葡萄籽提取物对缺血再灌注导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用.docVIP

　　葡萄籽提取物对缺血再灌注导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用 作者：洪权 肖博晗 魏日胞 汪杨 刘晓峦 冯哲 陈香美 【摘要】 目的 探讨葡萄籽提取物（Grape seed extract proanthocyanidin，GSPE）对缺血再灌注（I/R）导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用。方法 分离培养24月龄DA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。激光共聚焦检测细胞内活性氧(ROS)的浓度。结果 （1）衰老大鼠肾小管细胞经Antimycin A处理后，凋亡率增高，Caspase3，MDA，ROS明显增加，SOD下降；（2）经GSPE干预后，其凋亡情况明显好转，caspase3、MDA、ROS明显降低。SOD含量部分恢复（P＜0.05）。结论 老年大鼠肾小管细胞在I/R损伤时，ROS 堆积，线粒体损伤导致肾小管上皮细胞凋亡。GSPE可清除ROS从而达到抑制肾小管上皮细胞凋亡、减轻I/R损伤的作用。 【关键词】 衰老；活性氧；肾小管上皮细胞；缺血/再灌注损伤；凋亡 　　【Abstract】 Objective To explore the protective effects of Grape seed extract proanthocyanidin(GSPE）to the renal tubular epithelial cells of aging rats induced by ischemia and reperfusion. Methods The 24 month DA and ROS ulation of ROS and the damage of mitochondria lead to the apoptosis of renal tubular epithelial cell. GSPE can remove ROS and prevent the apoptosis of kidney tubular epithelial cells, lessen the impaired effects of I/R. 　　【Key ia/reperfusion; Apoptosis 　　急性肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭（ARF）和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞，老年人由于容易出现肾脏低灌注状态，如心肌梗死、脱水、利尿剂的使用以及老年人常见的肾动脉硬化因此更容易出现ARF。近年来ARF中活性氧（reactive oxygen species ，ROS）激增导致的肾小管上皮细胞凋亡引起了人们的关注〔1〕。很多的证据显示ROS能增加线粒体通透性转变孔道（PTP）的通透性，导致细胞色素C释放，引起凋亡。既往研究认为葡萄籽提取物(GSPE)具有抗氧化功能，可减少动脉硬化，能影响内皮细胞的凋亡增殖过程。本研究模拟并观察老年大鼠肾小管上皮细胞在缺血再灌注（I/R）损伤情况下，ROS在肾小管上皮细胞凋亡中起到的作用。使用抗氧化剂葡萄籽提取物（GSPE）给与实验性 治疗 ，观察GSPE抑制ROS产生后，是否对肾小管上皮细胞有保护作用及对老年高ROS负荷状态的治疗效果。 　　 1 材料与方法 　　1.1 实验动物与器材 雄性EM培养基、Trizol试剂、MMLV反转录试剂盒（美国Invitrogen公司），Antimycin A（抗霉素A，AA），Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（美国Biodesign公司），兔来源抗caspase3多克隆抗体（美国Santa Cruze公司），CaspACETM Assay System（ Promega公司）、Icycler PCR仪、radiance 2000激光共聚焦显微镜（美国Biorad公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 常规方法分离大鼠肾小管上皮细胞，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM 培养液，常规条件下培养。细胞以适当密度转种，实验前换用含0.5% FBS的DMEM 培养液继续培养。 　　1.2.2 实验分组 肾小管上皮细胞加入5.0 μmol/L GSPE和/或10 μmol/L antimycin A的10% FBS DMEM孵育2 h，37℃预温的PBS清洗之后换成正常的培养液，以模拟细胞缺血再灌注损伤状态。实验分为正常对照组，Antimycin A组，GSPE组和Antimycin A+GSPE组。 　　1.2.3 细胞凋亡检测分析 AnexinV/PI染色：胰酶消化细胞，PBS清洗2次，加入适量的荧光标记的annexin V试剂和PI，混匀后避光室温下孵育15 min，孵育后加入400 μl染色