蒲公英总DNA的提取及其RAPD.docVIP

　　蒲公英总DNA的提取及其RAPD 作者：李喜凤 ，杜云锋，张红梅，郝哲，许闽，白雁 【摘要】 目的建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选。结果建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系。25 μl反应体系中含有：1×Taq Mix buffer，50 ng DNA模板，0.4 μmol/L 引物，1.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25U Taq酶。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，38℃复性1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，4℃保存。结论这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。 【关键词】 蒲公英； 基因组DNA提取； 随机扩增多态性DNA技术 　蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.，碱地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag.或同属数种植物的干燥全草，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效，主要用于乳痈、肺痈、肠痈、痄腮、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛等症［1］。蒲公英品种繁多，资源丰富且来源复杂，目前对其鉴别一直沿用经典的性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。而这些方法的鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，在生物学上为物种的遗传表现型，受到遗传因素、生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等影响，具有很大的变异性，存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。 　　随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）技术是由美国杜邦公司的 科学 家arker：大连TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix：北京TIANGEN公司；10 mer随机引物：上海英骏生物技术有限公司合成；其余化学试剂均为国产分析纯。 　　1.3 仪器 　　DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂； Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析仪：美国BIO-RAD公司；梯度PCR仪：德国Biometra公司；GR22G型高速低温离心机：日本日立公司；微量移液器：德国eppendorf公司。 　 　2 方法 　　2.1 蒲公英叶基因组总DNA的提取和检测 在经典的CTAB法的基础上加以改良：称取0.5 g样品加入10%的PVP一起在冰上用玻璃砂在研钵中研磨，磨碎后转移至10 ml离心管中，加入10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液(250 mmol/L氯化钠，250 mmol/L Tris-HCl pH=8.0,50 mmol/L EDTA pH=8.0，5%PVP)，冰浴10 min，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，再用洗涤缓冲液洗涤沉淀1次。加入1 ml 2×CTAB提取缓冲液(100 mmol/l Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA pH=8.0，1.4 mol/L氯化钠，2%CTAB，5%PVP)，100 μl β-巯基乙醇，65 ℃温育3 h，不时振摇。4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中，加入适量的RNase A酶，37 ℃温育45 min，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提3次，4℃ 12 000 r/min离心10 min。取上清液分装于1.5 ml EP中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，于-20 ℃静置30 min或过夜，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，小心弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，在室温下干燥。将干燥的DNA沉淀溶解于100 μlTE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，1 mmol/L EDTA pH=8.0)中，4 ℃保存。经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析系统拍照，于蛋白核酸测定仪上测定其原始浓度，最后统一稀释成终浓度20ng/μl，保存-20℃备用。 　　2.2 RAPD-PCR初始扩增体系 参照常规的PCR反应中各组分的量及相关研究 论文 ，确定蒲公英RAPD-PCR初始的反应体系为：反应总体积25 μl，内含1.2×Taq Mix buffer(镁离子1.8 mmol/L、Taq酶1.5 U、dNTPs 0.3 mmol/L)、模板DNA 50 ng、随机引物0.2 mmol/L。根据预试验的结果，以S36(AGCCA-GCGAA)为引