蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的保护作用.docVIP

　　蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的保护作用 【摘要】 目的 研究蒲黄提取物对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，采用MTT法测定不同浓度蒲黄提取物对HUVEC的影响。以蒲黄提取物(100，50，10 mg/L)预处理细胞24 h，再加入100 mg/L oxLDL造成细胞损伤，取培养细胞上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，HUVEC用于测定细胞细胞间黏附因子(ICAM1)、单核细胞趋化蛋白(MCP1)mRNA的表达。结果 各剂量蒲黄提取物有显著的促进血管内皮细胞增殖的作用。与正常对照组比较，HUVEC经oxLDL作用后，细胞活性显著下降，LDH的释放量和ICAM1、MCP1 mRNA的表达显著升高;100、50、10 mg/L 蒲黄提取物可显著降低LDH活性,下调ICAM1、MCP1 mRNA的表达。结论 蒲黄提取物具有促进脐静脉内皮细胞增殖的作用，并可抑制OxLDL诱导的HUVECs ICAM1、MCP1 mRNA表达的上调和LDH的释放，从而起到保护血管内皮细 【关键词】 蒲黄提取物;内皮细胞;氧化低密度脂蛋白;细胞间黏附分子1;单核细胞趋化蛋白1;乳酸脱氢酶 血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的始动环节〔1〕。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是低密度脂蛋白致AS的关键步骤,可作为心血管疾病独立的危险因素直接损伤血管内皮细胞(VEC)〔2〕，损伤后的VEC合成和分泌的血管活性物质和细胞因子间平衡遭到破坏，导致内皮功能发生障碍，促使单核细胞与VEC黏附，这些改变对AS的形成起着始动的作用。蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲、东方香蒲或其同属植物的花粉，具有活血化瘀、止血、通淋之功效，对AS等多种心血管疾病具有良好的疗效。以往研究表明〔3，4〕，蒲黄提取物其具有降血脂、抗血小板聚集与抗血栓、增加冠脉流量及通过降脂来保护内皮细胞等作用。本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用oxLDL造成内皮细胞损伤模型，通过测定内皮细胞形态及功能的变化，探讨蒲黄提取物保护血管内皮、抗AS的机制。 　 　1 材料与方法 　　1.1 仪器 低温超速离心机(美国贝克曼公司);酶标仪(奥地利SUNRISE);DU800光分度计(美国贝克曼公司);PTC200 DNA扩增仪、凝胶图像分析系统(美国BIORAD公司产品);电泳仪(北京六一仪器厂)。 　　1.2 试剂 蒲黄(四川中药饮片有限公司,由重庆桐君阁曾宪策主任中药师鉴定为正品);胰酶(美国Gibco公司);内皮细胞生长添加物(美国BD公司);DMEM低糖培养粉(美国Gibco公司);优级胎牛血清(美国Gibco公司);oxLDL(中山大学,含量:2 mg/ml);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所);四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSD)(美国Sigma公司)。 　　1.3 蒲黄提取物的制备 取蒲黄200 g，分别用70%乙醇回流提取3次，溶剂用量依次为8,6,6倍体积，提取时间为60,60,30 min〔5〕。水浴浓缩得深褐色药液，真空冷冻干燥，得黄色粉末，放置4℃保存备用。用时溶于DMSO中，制成含药浓度为100 mg/ml的母液，再用细胞培养液按照一定比例稀释，使DMSO终浓度≤0.1%，用0.22 μm滤器过滤除菌后使用。 　　1.4 HUVEC的培养及鉴定 取健康产妇分娩胎儿的脐带，75%酒精擦拭脐带表面及断端，剪去夹痕，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗静脉腔内残血，灌入预热0.25%胰酶和0.02% EDTA的混合消化液使之充盈，放置于37℃水浴箱中消化8 min后，收集消化液并用Hanks液冲洗静脉，合并两液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，以DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、内皮细胞生长添加物100 mg/L)重悬细胞后，接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2的培养箱。待细胞贴壁后，换液1次，去除悬浮的死细胞和红细胞，以后每2～3天换液，细胞长至亚融合后，用含0.125%胰酶和0.01%EDTA的混合消化液消化传代，实验用第3～4代细胞。培养的细胞形态符合VEC特征，Ⅷ因子抗体免疫荧光染色阳性。 　　1.5 MTT比色法检测蒲黄提取物对VEC的作用 将80%融合生长的VEC以混合消化液消化，收集细胞，完全培养基稀释后以2×104/L的密度接种于96孔板。正常培养24 h后，洗去未贴壁细胞。换用无血清的培养基继续培养24 h，使细胞同步化。换用含5%胎牛血清的含不同浓度蒲黄提取物的DMEM培养液。蒲黄提取物以100 mg/L为最大浓度，依次为75、5