藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定.docVIP

　　藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定 作者：樊爱琳，师长宏，苏明权，薛莹，柏银兰，马静，刘家云，张建芳，程晓东，郝晓柯 【摘要】 目的： 克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化. 方法 ： 采用聚合酶链反应(PCR)方法，从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pProEXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化. 结果： 获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性 分析 发现融合蛋白主要在包涵体中存在，最后在变性条件下，用Ni2+NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白，纯化获得的融合蛋白纯度大于90%，ukamolova等［1］发现在Micrococcus Luteus（藤黄色微球菌）中发现了一种能促进细菌复苏生长的因子并命名为复活促进因子（Resuscitationpromoting factor, Rpf ）. Biketov等［2］发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态,且还是宿主免疫系统识别的靶抗原. 通过同源性分析发现结核分枝杆菌基因组可编码5 种Rpf样蛋白［3］. 我们拟克隆表达藤黄微球菌Rpf蛋白，进一步研究其生物学和免疫学特性，以建立临床结核分枝杆菌的快速分离培养方法，并评价其是否可作为候选结核亚单位疫苗的组分. 1材料和方法 1.1材料藤黄微球菌标准株为西京 医院 检验科细菌室保存；Taq DNA聚合酶、dNTPs，T4连接酶、HindⅢ，BamHⅠ及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒（Promega公司）；E.coli DH5α为本室保存，pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）（Qiagen公司）. 1．2方法 1.2.1引物设计登陆GenBank，根据藤黄微球菌Rpf基因序列(AC: Z96935)设计引物. P1：5′CGA GGA TCC ACC ATG GAC ACC ATG ACT CTC TTC AC3′含BamHⅠ酶切位点p2：5′TCA AAGCTT TCA GGC CTG CGG CAG GAC GAG CTC CT3′含HindⅢ酶切位点和终止码. 扩增片段为697 bp，由TaKaRa公司合成. 1.2.2藤黄微球菌基因组DNA提取刮取适量藤黄微球菌落，TE(pH 8.0)洗涤后重悬，加SDS至终浓度为10 g/L，蛋白酶K至终浓度0.1 g/L，55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇，1/10体积的3 mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1 h沉淀DNA，用无水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量无菌水中. 1.2.3藤黄微球菌Rpf基因的扩增、克隆及测序以藤黄微球菌基因组为模板，以P1和P2为引物，扩增目的基因. PCR反应条件：94℃ 60 s， 52℃ 60 s， 72℃ 90 s， 共30个循环，再于72℃延伸7 min. 回收PCR产物，经BamHⅠ和HindⅢ消化后，然后用T4连接酶连接入经同样酶消化的pUC19中，转化E.coli DH5α感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），随机筛选4个菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，37℃ 过夜，进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子质量参照，观察有无约697 bp大小的片段，将阳性克隆命名为pUC19Rpf,然后随机挑取3个克隆进行测序. 1.2.4重组质粒表达提取测序正确的重组克隆质粒，经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，回收目的基因条带，溶于50 μL双蒸水中. 取目的片段和同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pProEXHT质粒以 3∶1的比例混合，用T4连接酶连接，转化E.coli DH5α感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），37℃培养过夜. 随机挑取2个菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜. 各取1.5 mL提取质粒DNA，再以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定，挑选阳性克隆. 挑取1个阳性克隆接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18 h，取100 μL加到10 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养