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　　补肾固齿丸对人牙周膜成纤维细胞分泌TGF 作者：董伟　姜茵　吴亚菲　张静仪 【摘要】 　　目的 研究 补肾固齿丸水提液对人牙周膜成纤维细胞(PDLCs)TGF-β1分泌水平的 影响 ，以及在内毒素存在的条件下其分泌水平的改变。 方法 原代培养人牙周膜成纤维细胞培养液中加入内毒素和不同浓度的固齿丸水提液，在0、2、4、6天不同时间点用ELISA试剂盒检测培养上清液中的TGF-β1水平。结果最高和较高剂量药物组TGF－β1的分泌水平明显高于其他组（Plt;0.05）,在含有内毒素组中，最高药物剂量组的TGF－β1水平高于对照组，结果差异具有显著性（Plt;0.01）。结论补肾固齿丸能在一定程度上改变PDLCs分泌TGF-β1的水平，内毒素存影响药物对PDLC的作用。 【关键词】 补肾固齿丸 TGF－β1 内毒素 ELISA 【Abstract】ObjectiveTo study the secretion effect level of transforming groinistration of extracts from Guchiedication, on human periodontal fibroblast in vitro human teeth ulated e. ResultsA higher level of TGF-β1edication groups or the contaol group (Plt;0.01) in the existence of LPS.Conclusion This study indicates that Guchi PDLC, ay be less distinct in the existence of LPS. 【Key l ；链霉素100u/ml：TGF－β1双抗夹心ELISA试剂盒(RB分装)；内毒素 E.coli,055:B5(Sigma,德国)；补肾固齿丸水提液（ 九芝堂金鼎药业有限公司） 1.2仪器相差倒置显微镜(Olympus，日本)；CO2恒温孵箱(Forma，美国)；4℃低温离心机(Jouar，美国)；细胞计数仪（Beckman， 美国）；十二通道加样枪及原装配套加样头（Finnpipette，芬兰）；EL404微量反应板自动洗板机（BIO-TEK, 美国）；HTS 7000 plus多孔板紫外高效 分析 仪（PE， 美国）。 1.3方法 1.3.1补肾固齿丸水提液的制取及消毒按比例取1kg补肾固齿丸混合药物，清洗干燥后，加入适量无离子水熬制，过滤后取上清液，分装后γ射线照射消毒备用。 1.3.2牙周膜成纤维细胞的原代培养取正畸需要拔除的前磨牙置于含双抗的预冷DMEM中，用锐器刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织，经Hanks液反复冲洗后剪碎，加入30~50倍体积的0.5%Ⅰ型胶原酶，37℃消化20min，1000rpm离心10min，弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液洗涤两次后，将组织块转入一次性培养瓶内铺散开并吸去多余液体，倒置于37℃恒温5％CO2恒温培养箱，30min后翻转，加入培养液静置培养。细胞游出后，2~3天换液1次。待细胞铺满瓶底约80%时传代。经免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和角蛋白多克隆抗体染色确定得到的牙周膜成纤维细胞，取第3代生长稳定的牙周膜细胞进行实验。 1.3.3实验分组及加药将PDLC以4×104密度接种于24孔板，孵育48h后弃去原培养液，PBS清洗2次后分别加药。分为不含LPS（T组）和含LPS组（t组）两大组。T组中按固齿丸水提物在培养液中的终浓度分为T1、T2、T3组（T1 组：含10g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液,T2 组：含5g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液,T3 组：含2.5g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液） ，T0组：为空白对照组，加入只含10％胎牛血清的DMEM培养液。含LPS的 t组分组除LPS在每孔的终末浓度为50μg/ml外,其余与不含LPS（T组）一致。每孔总量为1ml，每剂量复3孔。于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育，在0、2、4、6天吸取培养液上清，4℃低温离心后分装，-20℃低温冰箱冻存待检。 1.3.4TGF－β1的测定平衡试剂盒至室温后，参照ELISA免疫检测试剂盒说明进行操作，在HTS 7000 Plus 上编制程序，使用标准品在465nm波长处读数得出标准曲线无误后开始正式实验。将上清液复融，各取100μl上清液加入相应孔板，包被后依次加入生物素、浓缩酶联物和显色液。最后由分析仪检测OD值并自动 计算 转换出样本含量pg/ml。TGF－β1测定结果除以相应