补肾通络中药对类风湿性关节炎Foxp3表达的影响.docVIP

　　补肾通络中药对类风湿性关节炎Foxp3表达的影响 【摘要】 目的：观察补肾通络中药对类风湿性关节炎患者Foxp3表达的 影响 。 方法 ：随机选择来我院健康体检者30例为对照组，同时选择我院门诊类风湿性关节炎患者50例为 治疗 组。治疗组患者（初治/或经过两周的清除期）内服补肾通络方3个月后，提取所有受试者外周血总RNA，逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测对照组和治疗组治疗前后Foxp3 mRNA的含量。结果：治疗组治疗前后外周血Foxp3表达水平均明显低于对照组（P＜0.01），治疗组治疗后外周血Foxp3表达水平亦明显高于治疗前（P＜0.01）。结论：类风湿性关节炎患者存在表达Foxp3的调节性T细胞数量减少和/或功能降低，这种调节性T细胞亚群的异常可能参与了类风湿性关节炎的发病和病变进展，补肾通络中药治疗类风湿性关节炎可能是通过上调Foxp3表达而发挥作用。 【关键词】 类风湿性关节炎 补肾通络中药 Foxp3 mRNA 实时荧光定量PCR法 β2m 调节免疫功能 类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以慢性破坏性关节炎为主要特征的系统性自身免疫疾病。RA源于免疫平衡失调，机体通过多种机制调控自身免疫应答，其机制十分复杂，调节性T细胞在免疫平衡机制方面起着重要作用，但其在RA发病机制中的作用尚不清楚。本 研究 对中药治疗RA后外周血调节性T细胞的特异性标志Foxp3进行测定，探讨Foxp3在RA发病中的意义，探讨中药调控T细胞介导RA适应性免疫应答的机制，为RA发病机制及用补肾通络中药防治RA提供 理论 依据。 1 资料与方法 1.1 临床资料 随机选取来我院体检的30例健康者作为正常对照组（对照组），同时选择我院门诊50例RA患者作为治疗组。对照组中男12例，女18例；年龄最小15岁，最大57岁，平均（52.19±10.50）岁；治疗组中男18例，女32例；年龄最小13岁，最大61岁，平均（51.21±11.73）岁；病程最短3年，最长15年，平均（7.5±2.6）年。所有RA病例均符合美国风湿病学会1987年的类风湿性关节炎分类诊断标准［1］。 1.2 治疗方法 治疗组（初治/或经过2 L。采用淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司生产）分离外周血单个核细胞，利用Trizol （美国Invitrogen公司生产）一步法提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA2 μg进行逆转录反应合成cDNA，-80 ℃保存。 1.3.2　 Foxp3定量标准品的构建 取上述cDNA2 μL，进行PCR 扩增。Foxp3 引物（上海博亚公司合成）： 5′-TCAAGCACTGCCAGGCG-3′和5′-CAGGAGCCCTTGTCGTCGGAT-3′。将PCR产物插入pgM-T载体（北京天为 时代 公司生产），并转化感受态大肠杆菌TOP10 （北京天为时代公司生产） ，经蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序鉴定目的片段插入正确。抽提质粒，并进行1∶10倍比稀释，制成107 ng/mL、106 ng/mL、105 ng/mL、104 ng/mL和103 ng/mL共5个标准品，分装后-20 ℃保存。 1.3.3　 外参照β2m定量标准品的构建　 取上述cDNA2 μL，进行PCR扩增。β2m引物（上海博亚公司合成）：5′-CCAGCAGCGAATGGAAACTC-3′和5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3′。余步骤同1.3.2。 1.3.4　 荧光定量PCR法检测Foxp3 mRNA相对含量 取上述cDNA1 μL，使用Quant SYBR green PCR kit（美国ABI公司生产）进行PCR扩增，终体积25 μL。同时进行各自标准品的扩增，每个样本均重复3 复孔。PCR反应条件： 50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min，扩增40个循环（95 ℃ 30秒， 52 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒） 。为了消除样本提取、逆转录和PCR反应过程中造成的差异，以Foxp3 mRNA 和β2m mRNA 含量的比值，即Foxp3的相对表达水平，作为评价Foxp3表达水平的指标。 1.4 统计学方法 结果采用SPSS 10.0 进行统计 分析 ，各组间比较采用方差分析。 2 结 果 2.1 疗效标准 参照国家中医药管理局1994 年发布的《中医病证诊断标准》类风湿性关节炎的疗效评定标准［2］。痊愈： 关节疼痛肿胀消失、晨僵消除；好转： 关节疼痛肿胀消失， 偶有痛感，晨起稍有僵硬；无效： 关节疼痛肿胀、晨僵同 治疗 前。 2.2 疗效观察 2.1.1 补肾通络中药治疗RA的疗效 50例RA患者中，痊愈28例，好转15例，无效7例，有效率8