表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人鼻咽癌细胞的生长机制.docVIP

　　表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人鼻咽癌细胞的生长机制 【摘要】 目的： 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigallocatechin3 gallate, EGCG］抑制人鼻咽癌E2Z细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌 治疗 的新靶点. 方法 ：用EGCG处理人鼻咽癌E2Z细胞, 应用 MTT试验观察不同浓度的EGCG对癌细胞生长增殖的 影响 ；流式细胞仪检测用药前后细胞周期的变化；用逆转录聚合酶链反应 分析 ras相关区域家族1A（RASSF1A）mRNA表达情况. 结果： 从E2Z细胞生长曲线判定EGCG对细胞生长均有抑制作用；流式细胞分析结果显示,G0/G1期细胞增加,S期细胞减少；经EGCG处理后,细胞中均有RASSF1AmRNA表达, 且表达随药物浓度增高而增强. 结论： EGCG对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的RASSF1A基因再转录,诱导该基因重新表达的结果. 【关键词】 没食子儿茶素没食子酸酯 RASSF1A基因 E2Z细胞系 甲基化 　0引言 　　鼻咽癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国的南部地区有很高的发病率. 鼻咽癌的治疗方法主要是放射治疗, 目前 的化疗药物疗效均不十分显著. 表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigallocatechin3 gallate, EGCG］能使因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，从而抑制肿瘤的生长［1］. 我们用EGCG处理鼻咽癌E2Z细胞,观察了其对E2Z细胞生长增殖的影响及ras相关区域家族1A(RASSF1A)表达的变化,以寻找治疗鼻咽癌的有效药物. 　　1材料和方法 　　1.1材料人低分化鼻咽癌细胞系（E2Z）由广东医学院分子生物学与生物化学教研室惠赠. RPMI 1640 培养基(美国Gibco 公司)，碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司. EGCG购于美国Sigma公司. 各PCR引物由上海生物工程公司合成. RTPCR试剂盒为德国QIAGEN公司产品，流式细胞仪为EpicsX2型. 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养及药物处理E2Z培养于含有100 mL/L灭活的小牛血清、10万U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI1640 完全培养基中，37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度培养箱孵育，取对数生长期细胞实验. 按每孔3000个细胞/孔接种于96孔培养板，细胞接种16 h后分别用不同浓度EGCG（0，50，100，200 mg/L）处理，每5孔为一药物浓度组，共接种4板，每日取1板，加入5 g/L MTT液20 μL, 37℃孵育4 h后弃去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,震荡10 min,使结晶物充分溶解, 在570 nm波长酶联免疫检测仪上测定各孔A值,求其平均数,绘制增值曲线. 　　1.2.2流式细胞术检测细胞周期同样方法接种处理E2Z细胞，48 h后胰酶消化，收集细胞，700 mL/L乙醇固定过夜，离心清洗后加入PI染液在流式细胞仪内检测各时相细胞比例. 　　1.2.3半定量RTPCRTrizol法提取各组细胞的总RNA(操作步骤祥见说明书). 以βactin为内参照. βactin引物序列：上游引物5′GTGCGTGACATTAAGGAG3′，下游引物 5′CTAAGTCATAGTCCGCCT3′，PCR产物大小517 bp;RASSF1A引物序列: 5′GCCCTCCAGCAAGAAG3′，5′TGAAGGCGTCCCAGTT3′, PCR产物大小362 bp.反应条件如下：50℃反转录30 min,95℃ 15 min,94℃变性1 min,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,进行30个循环,72℃扩展10 min. 　　统计学处理：实验数据用x±s表示. 采用SPSS16.0统计软件，方差齐时各组间两两比较采用LDS 检验进行，方差不齐时各组间两两比较采用Tamhanes T2检验进行，Plt;0.05 表示差异有显著性意义. 所有实验至少重复3次. 　　2结果 　　2.1EGCG对细胞增值的 影响 经0，50，100，200 mg/L的EGCG分别处理后,E2Z细胞生长增殖曲线示:各种浓度的EGCG处理组与对照组(无药组)相比,肿瘤细胞增殖均被抑制,且浓度越高,抑制越明显（图1）. 　　图1不同浓度EGCG处理E2Z细胞的增殖曲线（略） 　　2.2EGCG对E细胞周期的影响分别用不同浓度的EGCG（0，50，100，200 mg/L）作用E2Z 细胞48 h，然后收集各组细胞以流式细胞仪检测DNA 的含量. 结果表明：EGCG可以使其细胞周期G0/G1 期比例增加（Plt;0.05），