辛伐他汀对T淋巴细胞炎症反应的影响.docVIP

　　辛伐他汀对T淋巴细胞炎症反应的影响 作者：马晶 胡春燕 蒋庆渊 黄波 蔡振荣 【摘要】 目的 探讨他汀类药物对T淋巴细胞的抗炎机制。方法 体外培养人外周血T淋巴细胞，用不同浓度辛伐他汀进行处理，实时荧光定量PCR法检测T细胞肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素2（IL2）表达水平，免疫细胞化学SP法检测T细胞核因子kappaB（NFκB）移位情况。结果 辛伐他汀呈剂量依赖性抑制TNFα、IL2表达（P＜0.05），抑制NFκB移位入核（P＜0.05），且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时作用最明显。结论 辛伐他汀可对T淋巴细胞有抗炎作用，且可能是通过抑制NFκB的转位入核实现的。 【关键词】 辛伐他汀；T淋巴细胞；肿瘤坏死因子α；白细胞介素2；核因子kappaB 近年来普遍认为，炎症反应在心力衰竭(HF)进展中起重要作用。HF的炎症反应与机体的细胞免疫功能紊乱有关，T淋巴细胞在炎症反应中起着重要的作用。辛伐他汀是3羟3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，其抗炎作用日益受重视。研究发现，他汀类药物可以改善HF患者的心功能及预后与其抗炎作用有关〔1，2〕。该作用的确切机制以及不同剂量的他汀类药物作用是否有差别，目前少有报道。前瞻性研究认为他汀类药物对HF 治疗 无明显疗效〔3〕。本实验采用体外细胞培养方法，研究不同浓度的辛伐他汀对T细胞肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素2（IL2）表达分泌以及胞核细胞核因子kappaB（NFκB）移位情况的影响，为今后将他汀类药物用于临床HF患者的治疗提供实验依据。 　 　1 材料与方法 　　1.1 试剂和材料 　　植物血凝素（PHA）购自Sigma公司，用RPMI1640全培养基稀释，使用终浓度为5 μg/ml。辛伐他汀购自默沙东公司，用无水乙醇助溶。PCR试剂盒购自Promega公司。引物由大连宝生物工程有限公司合成。抗兔抗NFκB（p65）多克隆抗体购自Neomarkers公司。人外周血T淋巴细胞（Jurkat）购自 中国 科学 院上海细胞生物所。 　　1.2 实验分组 　　Jurkat细胞用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液37℃、5％ CO2条件下培养。取状态良好时的细胞接种于24孔培养板中，分为①空白组：加等量生理盐水；②刺激剂组：加5 μg/ml PHA；③～⑤药物干预组：分别加辛伐他汀1、5、10 μmol/L三个浓度，加药顺序为先加入辛伐他汀，2 h后再加PHA。调整细胞浓度至4×106/ml，培养4、24、48、72 h后收集细胞或上清液检测。 　　1.3 实时荧光定量PCR检测T细胞TNFα、IL2的表达 　　利用总RNA提取试剂（Trizol试剂）提取细胞总RNA。根据说明使用20 μl混和体系进行反应，逆转为cDNA后进行荧光探针标记的实时定量PCR。反应体系25 μl，进行40个循环。反应停止，以GAPDH作为内参照测定Ct值。各引物序列：TNFα上游：5′ACA ACC CTC AGA CGC CAC AT3′，下游：5′CAG GGC AAT GAT CCC AAA GT3′；IL2上游：5′TTC CAA AGA GTC ATC AGA AGA GGA3′ ，下游：5′GGC CTG ATA TGT TTT AAG TGG GA3′；GAPDH上游：5′GCC TCC CGC TTC GCT CTC3′，下游：5′TTG GCC AGG GGT GCT AAG3′。反应条件：95℃预变性10 min后，95℃变性5 s→60℃退火34 s，共计40个循环。取10 μl PCR反应产物进行1.5%琼脂电泳，光密度扫描后图片经Image软件分析，结果以目的基因与同时扩增的内参的PCR扩增产物Ct值的比值来表达TNFα、IL2的相对表达量。 　　1.4 SP法检测辛伐他汀体外对T细胞NFκB的影响 　　一抗为鼠抗NFκB p65单克隆抗体，二抗为生物素标记羊抗小鼠IgG，DAB显色。对照实验用PBS代替一抗。胞核中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性。每张涂片随机计数3个视野， 计算 胞核阳性细胞数占细胞总数的百分比作为该份标本的阳性率。 　　1.5 统计学方法 　　应用SPSS 11.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，各组间比较用方差分析。 　 　2 结 果 　　2.1 辛伐他汀对T细胞TNFα、IL2产生的影响 　　与PHA刺激组比较，辛伐他汀作用后，T细胞产生TNFα、IL2减少，并且随辛伐他汀浓度增加，改变程度越明显（P＜0.05）。且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时对TNFα、IL2作用最明显（P＜0.05