发光免疫分析技术的原理和特点.pptVIP

常见的商品化发光免疫技术及其分析比较 目前在应用上已经实现商品化的发光免疫分析产品，基本上可分为： 化学发光 时间分辨荧光—也称时间延迟光致发光 电化学发光---也称场致发光 一、化学发光 化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两种类型 酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶系统和碱性磷酸酶系统。分别以过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂以及螺旋金刚烷环氧化物和碱性磷酸酶未反应体系。其中在碱性磷酸酶反应体系中，螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯及其衍生物既可作为发光剂，又可作为氧化剂， 即它可通过自身内氧化启动发光反应，而无需氧化剂。 酶促发光的共同特点为：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过量，因此发光信号强而稳定，且发光时间长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单，成本较低，以往认为酶作为大分子，在标记小分子抗原时可能会影响其分子运动，但近年来，由于各种新型长臂双功能基团用于标记，以及多种高效间接标记技术的发展，这些已经不是问题。而酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间飘漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。 非酶促化学发光系统主要以吖啶酯、过氧化氢为发光系统。其共同特点为：发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，及含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短，如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次测量，所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐较长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。 二、时间分辨荧光 时间分辨荧光免疫分析是将三价稀土离子铕、镝、钐等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，并通过检测其荧光实现免疫分析。由于稀土离子荧光的激发光波长范围较宽，而发射光波长范围较窄，而且激发光和发射光之间的波长差距，即所谓Stokes位移较大，特别是荧光寿命大大长于常规荧光；因此采用了与常规荧光免疫不同的检测方式，即通过脉冲激光器间歇激发样品，同时检测器在其激发的间隙测定特定的荧光强度。这样不仅消除了杂散光的干扰，而且也大大减弱样品及反应杯中杂质所产生的背景荧光干扰。所以其检测灵敏度和现行范围大大高于常规荧光。 由于稀土离子在水相中的荧光效率很低，因此需要将其包裹在一个非水相的环境中才能检测到理想的荧光强度。最常见的做法是：在检测前先用酸将稀土离子从标记抗原或抗体上解离出来，然后在用由一系列表面活性剂构成的微囊吸收并包裹稀土离子。这种方式称为解离增强时间分辨荧光免疫分析法，其中的酸和表面活性剂等被称为增强剂。由于至今为止，在所有的时间分辨荧光分析法中，这种方法的灵敏度是最高的，近年来得到了广泛应用，已经成为目前最常见的时间分辨分析技术。但由于该方法需要在常规免疫分析中的洗涤步骤后，还要进行荧光素的解离和增强操作，因此分析过程有些繁琐。 除上述方法外，还有一种固相时间分辨荧光法，它使用一种特殊的络合物将三价稀土离子标记到抗原或抗体上；同时该络合物还可以维持三价稀土离子周围的非水环境，因此也充当了增强剂的角色。该方法的特点是无需增强剂，故操作简单，但灵敏度地域上述的方法。 时间分辨荧光免疫分析最大的不足，是环境及样品中同类元素导致的本底干扰。作为稀土资源大国的中国，特别是北方地区尤为不容忽视。虽然可以通过实验用水和实验室环境的特殊净化杜绝一部分干扰，但会带来测试成本的增加。况且由于病人体内这类元素的积累而造成的临床标本污染根本无法消除。因此人们研究开发了另一种称为直接时间分辨荧光测量法的技术，也有人称之为后标记技术。他首先使用一种不含稀土元素的特殊络合物标记抗原或抗体，等常规免疫分析中的洗涤完成后，再加入稀土元素并进行测定；这样就基本掩蔽了同类元素导致的本底干扰。但其灵敏度低，目前不能与上述两种方法相抗衡。 总之，时间分辨荧光技术的不足为测量方式复杂，仪器成本及维护费用高，环境及样品中同类元素可导致本底干扰等。 三、电化学发光 电化学发光在原理上与上述化学发光有所不同，其差异在于氧化反应是通过电极上的电化学反应产生的，而不是由氧化剂或发光剂自身内氧化产生。其标记物为三联双吡啶钌及其衍生物，并以三丙胺为还原剂。为降低检测成本并保证测量结果的重复性，目前普遍采用流动池测量方式。因此在启动发光时，首先 和TPA被泵入流动池，并在流动池的阳极表面发生氧化反应，形成【RU(bpy)3]3+和阳离子TPA，后者再形成自由基TPA,并将【RU(bpy)3]3+还原为激发态的【RU(bpy)3]2+ ，而激发态的【RU(bpy)3]2