人腹膜间皮细胞的体外培养.docVIP

　　人腹膜间皮细胞的体外培养 【摘要】 目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用 0.2% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTANa2 消化人大网膜组织，细胞悬液经 100 目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP 法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞 CD45 抗原阴性，证实培养的细胞的确是 HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离 HPMC 的方法。 【关键词】 腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜 腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。 早在 20 世纪 80 年代初，I-1640 完全培养液终止消化。用移液器分装于 10 mL 尖底离心管，1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于 50 mL 培养瓶，放置于 37℃，5% CO2 培养箱内培养。 1.5 腹膜间皮细胞的传代培养 原代细胞培养 24 h 后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每 3 d 全换液 1 次。约培养 5~8 d 细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS 漂洗 2 次，每瓶加入完全消化液 2 mL，在 37℃，5% CO2 培养箱内消化 15 min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入 4 mL 完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内 1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于 6 孔板（将盖玻片裁成 4 片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡 5~10 min，取出，在干燥箱内 60℃烘干 1 h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于 6 孔板内，每孔 3 片）内，加入适量完全培养液。继续在 37℃，5% CO2，湿度 95% 的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。 1.6 腹膜间皮细胞的鉴定 1.6.1 免疫组化鉴定 ①吸去 6 孔板内培养液，PBS（pH 7.2~7.4）洗 2 次，每次 3 min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗 2 遍，随即放入 10% 中性福尔马林固定 30 min；蒸馏水洗 4 次，每次 3 min。②加入 0.1% TritonX100（PBS pH 7.4 配制），室温 10 min，PBS 洗 3 次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45 无须修复，波形蛋白和第 8 因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育 60 min BPS 洗 3 次每次 5 min，去除 PBS。每张盖玻片滴加 50 L Elivision 试剂盒中的试剂 A，室温下 20 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min。每张盖玻片滴加 50 L Elivision 试剂盒中的试剂 B，室温下 30 min，BPS 洗 4 次，每次 5 min）。④DAB 显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的 DAB 显色溶液，在显微镜下观察 3~10 min；自来水洗 5 min，苏木素复染，0.1% 盐酸分化，自来水冲洗，PBS 返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过 70%、80%、90%、95% 酒精各 1 次，100% 酒精 2 次，每次 1 min；透明，过二甲苯溶液 3 次，每次 3 min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。 自然 通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。 1.6.2 扫描电镜鉴定 ①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入 PBS 中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入 4℃预冷的 3% 的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。再加入 4℃预冷的 1% 的四氧化锇，在 4℃固定 1 h。PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。③脱水：用 30%、50%、70%、80%、90%、100% 酒精逐级脱水，各 10 min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮 = l:1 的混合液中 10 min，然后放入醋酸异戊酯中 2 次，各 10 min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到 0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面