实验五AKP的纯化及Km的测定.ppt

实验五 兔肝碱性磷酸酶(AKP)的纯化及km的测定 一、用有机溶剂法部分纯化兔肝AKP 本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以降低酶的溶解度，使酶蛋白沉淀析出。 匀浆用缓冲液I ：离子强度低，能低渗破细胞膜 0.1mm PMSF(苯甲基磺酰氟)和0.02％NaN3 (叠氮钠)抑制蛋白酶活性 PH8.0 Tris使PH恒定与0.5mM MgCl2一起保护和稳定AKP 匀浆中加入正丁醇能使部份杂蛋白沉淀 含有AKP的滤液在终浓度33％的丙酮或终浓度30％的乙醇中是溶解的，而在终浓度60％的丙酮或终浓度 60％的乙醇中则不溶解，通过离心可使AKP得到部份纯化 保持低温 有机溶剂应预先-20℃冷却 操作时要注意慢慢滴加，并充分搅拌，以免局部浓度过高而使蛋白质变性失活 一般采用短时间离心，其沉淀也尽快溶于预冷的缓冲液。尽量减少与有机溶剂的接触时间，从而使AKP的变性失活降低至最低限度 注意事项： 各步操作尽量在冰浴中进行。 各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。 有机溶剂应预先冷却到-l0℃～15℃左右。 加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。 加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。 采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 二、AKP比活性测定 酶的比活性是指单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。因此，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度 根据国际酶学委员会的规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 因此测定样品的比活性必须测定 (1)每毫升样品中的蛋白质毫克数 (2)每毫升样品中的酶活性单位数。 碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。 酶活性单位表示：在37℃下保温15分钟产生1μg酚者为1个酶活性单位。 样品中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250染色法测定(见实验一)。 1． 0.02 mol／L磷酸苯二钠溶液： 先将蒸馏水 400ml 煮沸，加入磷酸苯二钠 2.18 g (磷酸苯二钠 ·2H20 2.54 g)，使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水加至 500ml，加2ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱内保存，称为底物溶液。 2．酚标准贮存液(1mg／m1) 称取重蒸馏苯酚1.0 g ，溶于0.1N盐酸中，并定容至1000ml。 3、酚标准应用液(0.05mg／m1) 取酚标准贮存液5ml，加蒸馏水稀释至100ml。 4．铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中暗处保存。 5．0.1M碳酸盐缓冲液 pH 10 称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g， 4-氨基安替比林1.5g，溶解于蒸馏水800m1中，定容至1000m1，置棕色瓶中贮存。 制作标准曲线 加入物 0 1 2 3 4 5 酚标应 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 碳酸盐bf 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 铁氰化钾 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 酶单位 0 10 20 30 40 50 立即混匀，510nm比色，读取各管吸光度 管 号 A B C D 标准 空白 各阶段稀释酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 ／ ／ 酚标应 ／ ／ ／ ／ 0.1 ／ pH8.8Tris醋酸镁缓冲液 ／ ／ ／ ／ ／ 0.1 碳酸盐bf