星形胶质细胞条件培养液对鱼藤酮染毒神经元的保护作用.docVIP

　　星形胶质细胞条件培养液对鱼藤酮染毒神经元的保护作用 作者：刘辉 尹芳秋 许崇亮 刘杰 徐冬梅 【摘要】 目的 观察星形胶质细胞条件培养液(ACM)对鱼藤酮染毒嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的神经保护作用。方法 将新生SD大鼠中脑星形胶质细胞分离、纯化并培养至第三代后，收集星形胶质细胞条件培养液加入到鱼藤酮染毒PC12细胞中，观察其对染毒神经元形态、活力及其合成与释放一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)和胞膜ATP酶(ATPase)的影响。结果 20%ACM可明显改善染毒神经元的形态和活力；与对照组比较，20%ACM还有效减少了染毒神经元NO、LDH的合成和释放，保护和提高了ATPase活性。结论 ACM明显促进鱼藤酮染毒PC12细胞的活力，其机制可能与减少NO、LDH合成释放及保护细胞膜ATPase的活性有关。 【关键词】 星形胶质细胞条件培养液；鱼藤酮；PC12细胞；保护 目前除发现部分家族性帕金森病(PD)与相关基因突变有关外，约90%的散发性PD与环境因素诱发密切相关〔1〕。其中，长期接触杀虫剂或除草剂与PD发病似有很强的相关性〔2〕。鱼藤酮(rotenone，R)是线粒体抑制类农药，长期接触该类化合物可导致黑质多巴胺神经元损伤，动物产生类似PD的行为学改变〔3〕。星形胶质细胞(astrocyte，Ast)是体内产生神经营养因子的主要细胞，Ast条件培养液(astrocyteconditioned medium，ACM)中含有神经生长因子和胶质源性神经营养因子等多种神经营养成分〔4〕。本研究应用ACM培养正常及鱼藤酮染毒嗜铬细胞瘤细胞(PC12)，观察染毒神经元的形态学改变和活力，以初步探讨Ast在鱼藤酮神经毒理机制中的作用。 　 　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和仪器 　　鱼藤酮(纯度97.6%)、四甲基偶氮唑(MTT)购自Sigma公司，DMEM/F12培养基购自Gibco公司，兔抗人GFAP多克隆抗体购自北京中杉公司，NO测定试剂盒购自碧云天生物公司，乳酸脱氢酶(LDH)、超微量ATP酶测定试剂盒由南京建成生物公司提供；酶标仪购自BIORAD公司，荧光显微镜E600为日本尼康产品。 　　1.2 Ast培养及ACM收集 　　取生后3d SD新生大鼠，断头取中脑组织，按照McCarthy〔5〕所述方法分离和纯化Ast，经3次传代后常规免疫组化GFAP染色鉴定。用于收集ACM的细胞按1.0×105个/cm2密度接种在培养瓶中，收集前两天换入无血清DMEM/F12培养基，收集的无血清ACM经离心后转入无菌玻璃瓶中，-20℃冻存待用。 　　1.3 PC12细胞鱼藤酮染毒模型的建立 　　PC12细胞以1×105个/ml接种于50 ml细胞培养瓶，加入DMEM培养液在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。细胞接种后，每2～3 d换液一次。培养的PC12细胞于对数生长期加入鱼藤酮工作液处理，使其终浓度分别为0.0、0.1、0.5、1.0 μmol/L。 　　1.4 ACM对染毒PC12细胞活力的影响 　　为摸索ACM促进PC12细胞活力的合适浓度，将正常培养PC12细胞分为5组：完全培养基组；10%ACM组(培养液中含10%ACM,90%完全培养基,余类同)；20%ACM组；50%ACM组；70%ACM组。继续培养12、24、48 h后,应用MTT法检测细胞活力。此预实验结果表明，20%ACM在染毒24、48 h时对PC12细胞活力的促进作用最为明显，故选用20%ACM来检测ACM对染毒PC12细胞的保护作用。PC12细胞接种于96孔板中，随机分成正常对照组、0.1 μmol/L鱼藤酮组、0.5 μmol/L鱼藤酮组和1.0 μmol/L鱼藤酮组，各实验组分别用完全培养基和20%ACM进行处理，继续培养12、24、48 h后,应用MTT法检测两种不同培养基中PC12细胞活力。 　　1.5 ACM对染毒PC12细胞合成释放NO、LDH和ATP酶的影响 　　PC12细胞培养于24孔培养板中，干预和分组同上。在上述各时间点收集各实验孔细胞培养液置入无菌EP管，分别检测NO和LDH含量。同时,将各时间点上每孔的细胞用胰蛋白酶进行消化,离心,弃上清,留下层细胞,每管加入0.3 ml生理盐水制成细胞悬液后,用超声波发生器处理30 s使细胞破碎，检测细胞裂解液中LDH含量和超微量ATP酶活性。LDH释放比=细胞培养液中LDH含量/(细胞培养液中LDH含量+细胞裂解液中LDH含量)。 　　1.6 统计学分析 　　实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0软件进行组间t检验。 　　2 结果 　　2.1 Ast的培养、纯化和鉴定 　　分离培养并纯化的Ast为扁平梭形或星形，有细长突起，胞浆丰富，胞核较大，境界清楚，