浅析CCL20在胸腺CD4+CD25+T细胞发育过程中的作用及其意义.docVIP

　　浅析CCL20在胸腺CD4+CD25+T细胞发育过程中的作用及其意义 【摘要】 　　目的: 研究趋化因子CCL20对小鼠胸腺CD4+CD25+双阳性T细胞发育的影响, 为天然调节性T细胞调控的研究提供基础数据。方法: 采用14.5 d龄胚鼠胸腺进行体外培养, 以流式细胞术（FCM）检测不同时间点胸腺CD4+CD25+细胞的变化, 同时计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果: 体外胸腺培养的第1～6天胸腺细胞比例, 细胞数量趋势变化与胸腺体内发育的第14.5、 15、 16、 17、 18、 19天CD4+CD25+双阳性T细胞的比例, 细胞数量的趋势变化相似; 在胸腺体外培养的第1～6天, CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例分别为58.29%、 12.14%、 6.08%、 17.78%、 9.06%、 4.04%, 占CD25+T细胞的比例分别为3.75%、 10.81%、 17.20%、 51.93%、 61.64%、 80.06%, 这一发育趋势与体内结果具有一致性。在4 mg/L的CCL20干预下, 胸腺体外培养的第3、 6天CD4+CD25+胸腺细胞分别从3.24±0.18、 3.96±0.24下降至1.27±0.11、 1.76±0.22（Plt;0.001）。结论: 体外培养的CD4+CD25+双阳性胸腺细胞数量和比例变化与体内发育变化趋势一致, CCL20明显下调胸腺CD4+CD25+的表达, 这将为天然调节性T细胞的调控研究提供有效的参考依据。 【关键词】 胸腺细胞 CD4+ CD25+ CCL20 体外胸腺器官培养 　　Sakaguchi等[1]研究发现, 给小鼠输入CD4+CD25+T细胞, 会下调免疫应答, 研究者们进一步在动物模型和临床病例证实该细胞参与自身免疫病的发生、 肿瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反应。随后的研究证实了该群细胞为CD4+CD25+foxp3+调节性T细胞, 小鼠体内输注经同种抗原活化的CD4+CD25+T细胞, 可引起特异性免疫耐受[2], 不仅如此, 它在免疫系统发育、 自身免疫、 肿瘤逃逸等过程中均扮演重要的角色, 成为当前免疫学研究的热点。调节性T细胞分为天然调节性T细胞和诱导调节性T细胞, 其中天然调节性T细胞对机体具有举足轻重作用。目前就其来源、 亚群、 特点、 转归及其在T细胞活化中的作用研究都有了长足的进展, 但对这群细胞在胸腺发育中的变化及调控因素尚不清楚。而CCL20是CC亚家族的趋化因子[3], 该趋化因子的受体分布于未成熟的树突状细胞、 T细胞、 B细胞上[4-6], 在固有免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用[7]。人们对CCL20的研究显示该趋化因子在胸腺中表达明显[8], 其受体CCR6是调节性T细胞的标志之一[9], 但其在胸腺中存在的意义以及其是否参与胸腺CD4+CD25+T细胞的发育尚不清楚, 因此本研究拟采用不同孕龄的胎鼠, 以体外胸腺器官培养（fetus thymus organ culture, FTOC）技术在体外以CCL20对调节性T细胞进行干预实验, 对CD4+CD25+T细胞的体内外发育状态进行比较研究, 以期为该群细胞发育和调控的深入研究提供了依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 8周龄左右成熟雌性和雄性BALB/c小鼠(H2d), 雌鼠120只, 雄鼠20只, 由复旦大学实验动物中心提供。不同日期的孕鼠由本实验室负责交配完成。细胞培养试剂RPMI1640（Gibco BRL公司）、 L谷氨酰胺（政翔化学试剂研究所）; 双抗（氨苄青霉素钠、 硫酸链霉素）（上海第四制药厂）; 小牛血清/NBS（上海华美生物公司）; 胎牛血清（浙江四季清生物制品有限公司）; FITC标记兔抗小鼠CD4单克隆抗体（mAb）（Becton Dickinoson公司）; PE标记山羊抗小鼠CD25 mAb（Becton Dickinoson公司）。显微外科镊、 剪（上海医疗器械有限公司）; 0.8 μm微孔滤膜（上海半岛实业有限公司）; D6450Hanao CO2培养箱（Heraeus公司）; FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinoson公司）。趋化因子CCL20（1 g/L, 达科为公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 孕鼠交配与鉴定 按照我们已建立的孕龄测定方法和体外培养系统, 取成熟雌性小鼠2～3只和雄性小鼠1只于前1 d晚9∶00左右合笼, 次日晨8∶00左右取出雌性小鼠, 以见到阴栓形成为确认怀孕日期, 并计算为0 d, 将其单独饲养并标记, 在14.5 d时再次观察腹部确认怀孕, 解剖孕鼠, 摘取胚鼠胸腺小叶用于实验[10]。 　　1.2.2 胚鼠胸腺器官的培养 医用明胶海绵切成1 c