第3章生化(刘建华)精要.ppt

Biochemistry Sixth Edition; 奶汁是所有哺乳动物的营养源。奶汁含有不同蛋白质。用MALDI-TOF质谱技术研究奶汁的蛋白质组成，依靠蛋白分子质量/电荷比将奶汁蛋白质各组分分开。;几乎在所有的生物过程中，蛋白质都起关键作用。生物化学的主要内容包括蛋白质结构和功能，以及蛋白质执行其生物功能的分子机制。 对蛋白质进行深入研究有赖于纯化蛋白质的获得。有了纯化蛋白，你能确定蛋白质序列、测定蛋白质三维结构、制备相应的抗体进行细胞定位、分析蛋白质功能、研究蛋白质执行其功能的机制。 可以从说生物信息学数据库获得相关的数据，尤其是序列数据，有助于你的研究。;基因组和蛋白质组 基因组：一种生物的全基因组序列以及对DNA序列进行的基因注释。基因组信息提供了生物体各种基因，以及这些基因所编码的功能产物。基因组是静态的。 蛋白质组：特定条件下，基因组的蛋白质表达形式。包括该条件下蛋白质种类、结构、修饰、功能、以及蛋白质之间的相互作用等。不同类型的细胞、同一类型不同发育状态的细胞、不同环境的同一类型细胞将有不同的蛋白质组。由于生物修饰蛋白方式多样，因此蛋白质组比基因组大得多。蛋白质组是动态的。;研究蛋白质功能的第一步是纯化蛋白质 生物化学有个谚语：“别在不纯的蛋白质上浪费你完美的思路。”;;透析去除小分子（依据分子大小差异）;凝胶过滤层析 (记住分子越大，流过愈快)。;离子交换层析， 依据蛋白质的净电荷差异;离子交换层析的介质;亲和层析：依靠配基与蛋白质之间特异的亲和性。;HPLC (凝胶过滤柱) 支持物颗粒细，分离效果好，但需要施加高压才有合理的流速。;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;;+ β-mercaptoethanol 破坏二硫键;;SDS能够测定多肽链的质量。;等电聚焦凝胶电泳;二维凝胶电泳;大肠杆菌的二维电泳结果;纯化方案合理性评价（考虑纯化度和回收率）;;超速离心分离大分子、测定大分子质量 超速离心能分离大分子、测定大分子质量。 能够确定大分子形状、密度、质量等参数。 研究分子之间的相互作用。 在离心条件下，一个颗粒穿过液相介质的移动速率用沉降系数s表示： s = m (1-n r) /f 其中m是颗粒的质量，n是颗粒的体积（根据颗粒的密度计算)，r是离心介质的密度，f是摩擦系数（颗粒形状的评价参数)。(1-nr)就是离心介质施加给颗粒的浮力。;颗粒的沉降速度部分取决于该颗粒的质量。如果形状和密度相同，质量越大的颗粒沉降速度愈快。 形状也影响沉降速度(因为颗粒的形状会影响颗粒沉降的粘度)。质量和密度相同，球形颗粒摩擦系数小，沉降速度快。 质量和形状相同，颗粒密度大，浮力(1-nr)小，其沉降速度快。 沉降速度也依赖于溶液密度（r）。溶液r 大，颗粒沉降慢。。实际上，nr 1颗粒上浮；当nr = 1颗粒不移动； nr ＜ 1颗粒上浮。;;图3.14 细胞组分的密度和沉降系数。;制备密度梯度介质用于密度梯度离心。;上样;水平离心。;回收已经分离的蛋白质条带; 离心沉降平衡技术能直接用来测定蛋白质的分子量。此时离心速度较慢使蛋白质沉降和蛋白质扩散达到平衡。用离心沉降平衡技术测定的蛋白质质量非常准确，条件温和、保留多亚基蛋白质天然的四级结构。而SDS只能提供解离多肽链的质量。注意，如果我们既知道一个多聚体蛋白质在变性条件下各个多肽的估算值，也知道沉降平衡离心的完整多亚基蛋白的质量，我们就能够确定该多亚基蛋白各个多肽链的拷贝数。;蛋白质氨基酸组成分析 6N HCl，110oC加热24小时 用离子交换层析分离氨基酸，根据出峰体积确定各氨基酸组分（图3.16）。 除了脯氨酸外，用茚三酮处理氨基酸产生深蓝色（但脯氨酸显黄色)。茚三酮衍生物的光吸收与氨基酸浓度成正比（氨基酸检测极限：1微克或10 nmol，相当于一个指纹的氨基酸含量）。用荧光胺代替茚三酮更灵敏，低至一奈克（10 pmol）的氨基酸也可以测出。 ;洗涤采用pH值逐渐增加的柠檬酸钠溶液。;荧光胺 ;茚三酮 ;Figure 3.18. The Edman Degradation. The labeled amino-terminal residue (PTH-alanine in the first round) can be released without hydrolyzing the rest of the peptide. Three more rounds of the Edman degradation reveal the complete sequence of the original pept