酪胺信号放大(TSA)技术-免疫组织化学IHC和荧光原位杂交FISH.pdfVIP

EU-BIO 试剂盒保存： 试剂盒中所有试剂均需4度保存，请在6个月内使用完。其中，FITC-tyramide、 Catalyzer需避光保存，Blocker可分装-20度保存，避免反复冻融。 试剂盒使用须知： 本试剂盒针对⽯蜡切片免疫荧光优化。同时也适用于冰冻切片免疫荧光和铺片细胞 免疫荧光。对于冰冻切片免疫荧光，在切片⽔化，固定后从本试剂盒操作说明第4步加 Blocker开始操作。⽽对于铺片细胞免疫荧光，则在固定，通透后从本试剂盒操作说明第 四步加Blocker开始操作。 与传统使用荧光基团偶联⼆抗的显⾊⽅法相比，使用我们的显⾊系统可以将免疫荧 光检测的灵敏性提⾼100倍以上，能显著地提⾼信噪比。 使用本试剂盒操作时，Catalyzer和FITC-tyramide的使用均需新鲜配制。 使用本试剂盒，需自备以下试剂： PBSTx：PBS加0.3%的TritonX-100 柠檬酸钠缓冲液（10mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20， pH 6.0）： Trisodium citrate dihydrate 2.94g 加双蒸⽔到1000 ml 混匀⾄溶解，使用盐酸将pH调制6.0 加⼊0.5 ml的Tween 20，混匀。可4度长期保存。 操作步骤： 1、⽯蜡切片脱蜡⾄⽔：（⽯蜡切片脱蜡前应置于60度30分钟） ⼆甲苯I、II，各洗3分钟； ⼆甲苯与酒精1：1、 洗3分钟。 梯度酒精：100%I，3分钟；100%II，3分钟；95%，3分钟；70%，3分钟；50%，3分钟。 自来⽔洗5分钟。 2、抗原修复： 将0.1M柠檬酸盐缓冲液（PH=0.6），用微波炉加热⾄沸腾，将脱完蜡及复⽔好的片⼦ 置于缓冲液中，持续煮沸20分钟。注意此过程中，玻片上组织要⼀直浸没于缓冲液中， 以保证组织的抗原修复效果。 20分钟后，将玻片立即放⼊自来⽔中10分钟。主要不要烫伤。 为了节省试剂，使用疏⽔笔将组织圈出，后续的加样与液体置换操作对象 为疏⽔圈，加样体积每张玻片100-200ul。 3、PBSTx：5分钟，2次。 EU-BIO 4、使用Blocker常温封闭1小时。 5、使用提供的blocker配制1抗抗体稀释液，具体的稀释比例因抗体⽽异，⼀般为Western Blot抗体稀释比例的10倍。1抗室温孵育1小时。 6、PBSTx：5分钟，2次。 7、4%Catalyzer处理组织15分钟。 8、PBSTx：5分钟，2次。 9、使用提供的Blocker配制AB solution稀释液（AB solution）两种，根据您⼀抗来源选择 小鼠：M-AB solution，或者兔⼦：R-AB solution），稀释比500：1。2抗室温孵育1小时。 10、PBSTx：5分钟，5次。 以下操作均需避光。 11、使用提供的Amplifier稀释FITC-Tyramide染料，稀释比为1000:1，然后再加⼊0.02%的 Catalyzer（此处可以先配制100ul2%的Catalyzer，再按1:100稀释比使用），混匀配制成荧 光显⾊液。室温避光孵育10-30分钟。 12、PBSTx：5分钟，5次。 13、1ug/ml DAPI室温染⾊10分钟，进⾏核共染。 14、防淬灭封片剂封片，镜检。 免疫荧光小贴⼠： 尽量使用新鲜制备的样品。 任何⼀步操作中都不要让片⼦⼲掉。 抗原修复的好坏直接影响染⾊的强弱。 好的1抗是免疫荧光成败的关键。 使用本试剂盒显⾊系统可以明显提⾼免疫荧光的灵敏度和信噪比。 延长PBSTx洗的时间，可以降低染⾊背景。