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第六章 免疫电镜 常规电镜：形态结构 免疫学方法： 组分 免疫电镜：形态结构+组分 免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫电镜要解决的两个问题 免疫电镜标本的结构保存与抗原活性保存问题——二者经常矛盾 在电镜下显示抗体的合适的标记物 ξ1低温包埋超薄切片法制备免疫电镜标本 1 取材与固定 [目的] 将所取样本尽可能固定在生活状态下，并保存样本的抗原活性 固定剂 固定液 4%FA(in 0.1M PB) 或4%FA+0.01~0.5%GA(in 0.1M PB) 免疫光镜预实验 取材 FA+GA固定液中4°C 2~3h(中间1-2h可取出修块) 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB） 4°C 2h 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过夜中间换液2~3次 *常规电镜标本可在冲洗液中存放1~2周，但免疫电镜标本不行， 因为GA浓度很低微细结构变化大 2 脱水 [目的]去除样品中的水，为包埋剂（水溶性）的均匀浸透做准备 脱水剂：乙醇，甲醇，异丙醇，乙醚，或丙酮（梯度脱水） 脱水剂对抗元的灭活作用随温度降低，但不能低到脱水剂结冰的温度，所以应选择结冰温度低的脱水剂 预先冷却好全部用具 3 浸透与包埋 [目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 包埋剂 （几类物质的混合物） 羟丙基甲基丙烯酸酯（基本成分） 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） 苯甲酸烷基乙醚（激活剂） 常规与免疫电镜包埋剂比较 化学活性 亲水性 固化条件 注意事项 称量要准确，尤其量少的 胶拌时避免产生气泡（O2自由基聚合阻聚剂） 使用无色透明胶囊（无色明胶或聚酯胶囊） 包埋剂加满加盖 用具全部预先冷却 紫外照射聚合箱 4 切片 亲水性包埋剂切片与非亲水性包埋剂切片技术要领上有所不同 6 免疫标记后染色 1.8%醋酸铀+0.2%甲基纤维素, RT, 5m *不宜长时间冲洗（控制在5~10s），易脱色 *任何一步都不能让载网干 ξ2冰冻超薄切片法制备免疫电镜标本 [特点]： 简便，快，抗原活性保存好 结构保存相对差，价格贵 1 取材与固定 [固定目的]将各种组分尽可能固定在生活状态下，醛固定后蔗糖可渗透细胞 FA(2~4%)+GA( 0.01~0.5%)固定液中4°C 2~3h (中间1-2h可取出修块) 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过夜，中间换液2~3次 *固定时间越长，结构保存越好，抗原活性保存越差 *对于可溶性的物质（细胞溶质，分泌蛋白）需加GA以避免免疫反应过程中可溶性的物质被抽提 *对于膜或细胞骨架上的物质而言，可溶性物质的被抽提有利于膜或细胞骨架上物质的接触免疫标记物 2 冷冻保护 将标本块转移到蔗糖（2.3M in 0.1M PB）溶液中，不少于30m 3 冷冻 将标本块固定到样品架上，并一同在液氮中冷冻，然后将样品架迅速转移到冷冻切片室中（-90~-110 °C ） 4 冰冻超薄切片 在冰冻超薄切片机上进行 * 玻璃刀，钻石刀 切片存放 6 免疫标记后染色 染色液：4%醋酸铀+0.3M草酸（与醋酸铀等体积），用5%NH4OH调pH至7~7.5 RT, 5m 7 甲基纤维素包埋 [目的]:防治干燥时产生皱缩 2%甲基纤维素水溶液+2~4%醋酸铀（使醋酸铀最后的浓度为0.1~0.4%） 所形成甲基纤维素的最终厚度与结构保存和图像反差关系密切，干涉色呈金色，蓝色适宜 厚，结构保存好，牺牲图像反差 薄，图像反差好， 留下干燥带来的违迹 厚度取决于移走的甲基纤维素溶液量 ξ3 电镜下显示抗体的标记物—胶体金 溶胶的重要特征：微小的颗粒，颗粒越大越不稳定 胶体金：1~100nm(80nm红，80nm兰) 制备： 工业 实验室 HAuCl4+（单宁酸 +柠檬酸钠） Au 胶体金的优点 结合原理为物理吸附 重金属，图像反差好 颗粒均匀，圆球形状，易于辨认 做成不同大小的尺寸，可进行双标记 可同时用于免疫透镜，免疫扫描电镜 胶体性质 吸附离子而带电 吸附大分子物质（物理） 胶体沉聚（在胶体金中加入一定量的电解质如NaCl,马上可以看到胶体金的沉聚现象-由红色变成蓝色，放置一段时间或超速离心后在试管底部得到蓝色沉淀） 胶体保护（在胶体金中加入一定量的亲水大分子可使溶胶变得稳定，再加NaCl时不再出现沉聚现象 ） 2 胶体金-抗体复合物制备 抗体蛋白不含或只含极少电解质 最适pH：在接近或略高于抗体的等电点时复合物最稳定（高0.1~0.2 pH） 查抗体的等电点 IgG，最适pH=9.0~9.2 PA, 最适pH=5.9~6.