蒋-2016秋 基因结构与功能分析精要.ppt

* * Fig 20-24 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 Methods for Identifying Biological Functions of Genes 通常采用基因功能获得和/或基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，来鉴定基因的功能。 细胞水平 in vitro 整体水平 in vivo 　　基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。 方法： 转基因技术 基因敲入技术 一、采用功能获得策略鉴定基因的功能 转基因技术（transgenic technology）指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。 （一）用转基因技术获得基因功能 （二）用基因敲入技术获得基因的功能 基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。 转基因动物制作原理示意图 转基因动物中外源DNA的检测 染色体和基因水平： 分离基因组DNA，进行斑点杂交，Southern杂交和PCR分析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。 转录水平： Northern杂交，Rnase 保护分析，RT-PCR。 蛋白质水平：Western。 转基因动物模型存在一些亟待解决的问题： 外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能； 外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等； 整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。 转基因技术在不断完善 构建转基因表达载体时，选择只在特定细胞或特定时期才启动表达的启动子，可使外源基因获得时空特异性的表达。 可调控的基因表达系统也是一种常用的方法： 例如四环素调控系统，使转基因动物体内外源基因的表达受诱导剂（四环素）的调控。 基因敲入是基因打靶（gene targeting）技术的一种。基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。 基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，二者的最大区别就是基因打靶能去除和/或替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。 　　　基因打靶是利用DNA同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（gene knock in）。 　　　目前主要在小鼠ES细胞中进行． 基因打靶 （ gene targeting） 含有两种筛选标志：neo 阳性筛选标志 HSV-tk 阴性筛选标志 neo阳性筛选标志： neo基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，ES细胞能在含G418的培养基中生长 1 、构建打靶载体 启动子 HSV-TK 同源序列 同源序列 Neo HSV-tk阴性筛选标志： 　　 单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因。该基因产物可分解单核苷酸类似物（如GCV）而生成毒性产物，产生自杀效果。 　　HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，载体部分一般不整合，Tk-基因往往丢失。打靶细胞在含有GCV的培养基上能够生长。那些把整个基因打靶载体整合到核基因组上，而同时获得neo和HSV-tk两个基因的打靶细胞，由于GCV的特异致死性作用而无法存活。 基因打靶的原理示意图 功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。 方法： 基因敲除（gene knock-out） 基因沉默 ( gene silencing) 二、采用功能失活策略鉴定基因的功能 基因敲除（gene knock-out）属于基因打靶技术的一种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。 在ES细胞中定点破坏内源基因，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析；某些基因在不同的细胞类型中功能不同，完全敲除会