高浓度葡萄糖对培养的人视网膜色素上皮细胞细胞表面黏附分子.docVIP

　　高浓度葡萄糖对培养的人视网膜色素上皮细胞细胞表面黏附分子 作者：韩小霞，惠延年，宋虎平，王海涛，张晓光，刘百军 【摘要】 研究 高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的 影响 。 方法 ：用免疫荧光法检测5.6mmol/L和30.0mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面ICAM-1表达量，MTT方法检测两种浓度葡萄糖作用下48h hRPE表面黏附白细胞的数量。结果：30.0 mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面荧光着色密度分别为5.6mmol/L葡萄糖作用下荧光着色的2.4，3.8，4.0倍。30.0mmol/L葡萄糖作用48h后hRPE细胞表面黏附的白细胞数量是5.6mmol/L葡萄糖组的2.34倍，有统计学显著性差异（P ＜0.05）。结论：高糖可以促进体外培养hRPE细胞的ICAM-1表达，提示RPE细胞在高糖作用下可能参与了糖尿病视网膜病变的早期病理反应。 【关键词】 人视网膜色素上皮细胞 0引言 近年的研究表明，糖尿病发病机制中有低度慢性炎症反应参与，白细胞通过细胞间黏附分子（ICAM-1）引起在视网膜附着和活化，造成视网膜微血管渗出等炎症改变。其中高浓度葡萄糖的直接作用也得到研究者的证实[1]。高糖可以抑制微血管内皮细胞的增生[2]，降低细胞连接蛋白的表达量，从而使细胞的形状发生改变，使大分子物质突破内皮细胞屏障[3]。视网膜色素上皮细胞作为视网膜的外屏障，转运大量葡萄糖为视网膜神经感觉层提供能量[4]，更受到血糖波动的影响，发生病理和功能的改变。但是在体外研究中有关RPE细胞在高血糖的作用下的改变还少有报道，我们研究高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮ICAM-1表达的影响，探讨RPE细胞是否参与早期DR病变的病理变化过程。 1材料和方法 1.1材料 我们以角膜移植供体眼做原代培养人RPE（hRPE）细胞，建立有限hRPE细胞系, 采用第3～6代细胞作为实验细胞[5]， 抗人角蛋白抗体和KG8.13抗体免疫组织化学染色鉴定细胞。细胞培养采用正常浓度葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）干粉（Gibco公司，葡萄糖浓度：5.6mmol/L）；每袋正常葡萄糖浓度DMEM培养基干粉添加24.4mmol D-葡萄糖（Sigma公司），配制成含高浓度葡萄糖的DMEM培养液（葡萄糖浓度：30.0mmol/L）。 1.2方法 1.2.1 MTT比色法 绘制正常浓度葡萄糖培养液及高浓度葡萄糖培养液培养的hRPE细胞生长曲线。取近铺满的RPE细胞用2.5g/L胰酶消化后，以含100mL/L新生牛血清（四季青公司）正常浓度葡萄糖 DMEM细胞培养液重悬，5×106/L的密度接种于96孔板，待24h细胞贴壁伸展后，换用含不同浓度葡萄糖（Ⅰ组5. 6mmol/L，Ⅱ组30.0mmol/L）DMEM细胞培养液在37℃、5mL/L CO2孵箱中培养， 每2d更换培养液，每组设有3个副孔。每24h随机选择一块96孔板，每孔加入5g/L的MTT（Sigma公司）溶液200μL，孵箱孵育4h，吸出上清，加入二甲基亚砜（DMSO）20μL，在摇床上震荡10min，设空白对照孔，于酶标仪上用490nm波长读取吸光度，根据每组吸光度平均数值描绘细胞生长曲线[6]。 1.2.2免疫荧光法检测hRPE细胞ICAM-1的表达 RPE细胞消化后，以5×106/L的密度接种40μL细胞悬液于预先放置在24孔培养板中的8mm×8mm盖玻片上，4h后加含100mL/L灭活小牛血清的DMEM正常浓度葡萄糖培养液1mL，在37℃、50mL/L CO2孵箱中培养24h后，按不同组分别添加含5.6mmol/L，30.0mmol/L 葡萄糖的DMEM培养液，每组包括6个培养孔，每2d更换培养液。每天分别取出不同组细胞爬片，0.01mol/L PBS洗2次，950mL/L酒精-20℃固定20min，空气干燥，-20℃保存。固定的细胞爬片恢复至室温，经0.01mol/L PBS反复冲洗，滴加5mL/L H2O2 /甲醇室温孵育30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗后0.01mol/L PBS震洗，滴加1∶50正常羊血清，室温放置30min，倾去，滴加鼠抗人ICAM-1 mAb( Santa Cruz公司，1∶50)，湿盒内4℃过夜，PBS漂洗3min，3次，滴加荧光素标记羊抗鼠IgG ( Santa Cruz公司，1∶50) ，37℃放置30min后，PBS漂洗3次，每次5min。缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察、照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照和正常羊血清（中山公司