提取dna步骤.docVIP

3.1.2.1.1试剂配方 试验中所用的试剂配方如下： CTAB-free缓冲mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）200mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）50mmol/ L NaCl 14.6g 250mmol/ L 3×CTAB提取缓冲液mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）00mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）mmol/ L NaCl 81.76g 1.4mol/ L 1×TE：1L 试剂名称 所需量 终浓度 1.0mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）mmol/ L 3.1.2.1.2 DNA提取 取样：在甜叶菊生长的早中期，于田间按取样顺序取顶部幼嫩叶片6片左右，然后置于-70℃冰箱保存。 研磨：每个样品取0.2g（约3片）左右细嫩叶片放入研钵中，立即加入适量液氮，迅速研磨成极细的粉末（可加入液氮重复一次）。在粉末回潮以前迅速装进已经用液氮预冷的2ml离心管中。 冰浴：在离心管中加入4℃预冷的mL CTAB-free缓冲2%β-巯基乙醇振荡混合后冰上放置20min12000rpm离心5min，弃上清加入预热至65的3×CTAB提取缓冲液2% β-巯基乙醇，重悬沉淀，65水浴h，每隔10min左右振荡一次。 抽提：将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，加氯仿：异戊醇（24 : 1）缓慢翻转混约5min4℃下12000rpm离心10min将上清液转至一支离心管中加入等体积-20预冷的无水乙醇加入体积预冷的，轻轻混匀，-20析出沉淀4℃下12000rpm离心min，弃上清加 1.0mol/ L NaCl溶液，轻摇至沉淀重新溶解加入体积预冷的加入等体积-20预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-204℃下12000rpm离心min，弃上清70%乙醇清洗两次室温干燥30min溶于μL TE 缓冲液，-20保存备用.2.2.2 PAGE胶的制作 聚丙烯酞胺凝胶电泳试剂准备： 1）30%Acr-Bis：290g丙烯酞胺，10克N, N-甲叉二丙烯酞胺，加ddH2O至1000m1。 加ddH2O00m1，溶解后加入冰乙酸57.1ml，加ddH2O定容至1000ml。 PAGE胶的制作过程为： ① 用洗涤剂将两块玻璃板彻底洗净并晾干； ② 将胶条放置于大玻璃板两侧，小心的将小玻璃板扣在上面； ③ 将两块玻璃板垂直放到封胶槽中并紧贴挡板，小玻璃板朝外； ④ 往封胶槽中加入融化好的1%琼脂溶液，待凝固。 ⑤ 按8ml30%丙烯酞胺凝胶母液+21mlddH2O + 600μl 50×TAE + 300μl AP + 30μl TEMED的比例配制凝胶液混匀，沿玻璃棒将溶液注入两块玻璃板空隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部。将梳子的边缘用擦净后小心的插入（最好先以一端先插入，然后全部插入，可以防止产生气泡）。 ⑥ 聚合1h左右即可进行电泳。 3.2.2.3 PAGE胶（8%）凝胶电泳 1. 将胶板从封胶槽中取出，小心去除气泡； 2. 用自来水将胶板两面洗净，在下槽加入约150ml 1×TAE后将胶板装入电泳槽中； 3. 上槽加入约350ml 1×TAE，小心的拔出梳子； 4. 在PCR产物中加入0.25倍体积的上样缓冲液，点样2μl，小心不要串样，尽快点完； 5. 插上电线，以恒电压120V电泳2～2.5h，终止电泳。 3.2.2.4 PAGE胶的染色及拍照 银染法试剂准备： 染色液（0.1%AgNO3）：1g AgNO3加至1L ddH2O中。 显色液（15g/LNaOH，0.019%NaHCO3，0.03%甲醛）：称取15gNaOH和0.019gNaHCO3溶于约800ml ddH2O中，加入3ml甲醛，定容至1L。此溶液为现配现用的。 固定液（10%冰醋酸）：100ml冰醋酸加进900ml ddH2O中。 染色过程： 1. 剥胶：用水将粘在玻璃板上的胶冲进准备好的染色盆中，将水沥干； 2. 染色：往装有胶的染色盆中加入约100ml染色液，放在摇床上振荡15min； 3. 漂洗：去除染色液，用ddH2O轻轻振荡清洗两遍，清洗动作尽量快。 4. 显色：将约100ml显色液倒入染色盆，放在摇床上振荡直至条带全部出现并全部清晰可见。 5. 固定：将显色液倒出，加入约100ml固定液放置2min左右，再用ddH2O清洗两遍即可用相机拍照。 实验注意事项： 1.研磨过程要快，带粉末未回潮前就转移到有编号的试管中，研磨好的样品要放在冰箱中或插入冰中，由于甜叶菊极易被氧化，一般不要在空气中暴露太长时间，液氮使用应节约，不能过于浪费，一般研磨2-3次即可，选取叶片尽量选新鲜，不干净的叶片用清水冲洗