分光光度计检测葡萄糖.docVIP

如何用分光光度计检测食品中的葡萄糖 ????1、分析原理：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。????2、仪器：722分光光度计。????3、试剂：除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。????（1） 乙醇。????（2） 40%三氯乙酸：称取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。????（3） 2 mol/LNaOH 溶液：称取8gNaOH， 用水溶解并稀释至100ml。????（4） 1 %邻联甲苯胺溶液：称取0.1g 邻联甲苯胺溶解于10ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4冰箱保存。????（5） 乙酸缓冲液 （pH5.0）：称取14.28g乙酸钠（CH3COONa?3H2O）溶于水中，加入2.7ml冰乙酸，并调节pH5.0，用水定容至1L。????（6） 葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma公司）用水溶解，使酶含量为100U/ml。4冰箱保存一周。????（7） 过氧化物酶溶液：0.010g 辣根过氧化物酶溶于10ml 水中，4冰箱保存一周。????（8） 酶溶液：取100ml乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。4冰箱可保存七周。????（9） 酶空白液：取100ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。4冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）????（10） 葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80干燥至恒量。精确称取0.050g，用水移入100ml 容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5mg/ml。????4.操作步骤之样品的处理：????（1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，/加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。????（2）液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。（如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15min，上清液备用。）????（3）新鲜牛乳等样品：吸取0.5～2ml样品，用水稀释，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，过滤。吸取5ml滤液，用2 mol/LNaOH 调节pH至中性，用水定容至10ml，备用。????（注：样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质，40%三氯乙酸用于沉淀蛋白。） ????5、测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作（单位：ml）????上述试剂混合后37 水浴反应 15 min，625 nm 测定吸光度值。（注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。）????6、计算：根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。计算公式：X= (As-Ab)×V×F×0.10.5×m????式中: X——样品中葡萄糖含量，g/100g；As—— 由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg；Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg；V——样品定容体积，ml；F——稀释倍数；0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml；m——样品质量，g；0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。????7、注意事项????（1）此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。????（2）如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。