霍乱实验室检技测术20110318.pptVIP

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霍乱实验室检技测术20110318

霍乱弧菌实验室检测技术; 霍乱的流行情况 霍乱的生物学性状 样本的采集 检验操作程序 荧光定量PCR方法检测O1群、 O139群霍乱弧菌及霍乱毒素 ; 由O1群、 O139群霍乱弧菌引起的霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征,被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病,也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。;;;弧菌的分类 形态与染色 抗原结构、血清群 生长与培养特性 生化反应特性 对外界的抵抗力 药物敏感性; 弧菌的分类(包括5个属) 弧菌属 霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等 气单胞菌属 邻单胞菌属 发光菌属 水栖菌属 ; 形态与染色 革兰氏染色阴性,两端钝圆或稍平 单鞭毛、鱼群样排列,菌体弯曲呈弧形或逗点状 暗视野显微镜下,霍乱弧菌运动活泼,呈穿梭状或流星状 培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润 ;;;; 抗原结构、血清群 H抗原和O抗原 根据O抗原不同,分为200多个血清型 根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子和型特异性抗原因子 O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型 小川型含A、B抗原因子,也含少量C因子成分 稻叶型含A、 C因子 彦岛型含A、B、C因子; 生长与培养特性 好氧同时兼性厌氧,最适生长温度37℃ 钠离子可刺激生长 耐碱不耐酸 初次分离时常用碱性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培养, 霍乱弧菌经6~8h增菌后可在液体表面大量繁殖,形成菌膜 ;; 生化反应特性 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 产酸不产气 迟缓发酵乳糖,不分解阿拉伯糖 氧化酶试验 弧菌属细菌大多为阳性 粘丝实验 弧菌属细菌大多为阳性 ; 对外界的抵抗力 在河、井、海水中可存活13周以上 食物和海产品上存活7天左右 对低温和碱耐受力强 (在食品上的弧菌于冰箱保存(0~5度)比室温存活时间长) 对热、干燥、太阳直射敏感 对含氯制剂、碘制剂敏感 对酸和强氧化剂极敏感 煮沸100度1~2min即可被杀死 药物敏感性 细菌带有可传递的耐药质粒 近年产生多重耐药株(丁胺卡那霉素 、强力霉素、复方新诺明 ) 诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性 ;霍乱的致病性 主要毒素 霍乱肠毒素CT 小带联结毒素zot 辅助霍乱肠毒素ace 溶血素、溶细胞素、志贺样毒素 O139 群除具有上述 O1 群的致病物质外,还存在荚膜多糖和特殊 LPS 毒性决定簇,可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜 上。 ; 腹泻患者样本采集 水样便采1~3ml,成形便取指甲大小量 肛拭子:生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内3~5cm处旋转取出 呕吐物采1~3ml 标本和碱胨水比例为1:5 水样及液体标本采集 采集相对静止表层水(30cm内)500ml 其他液体标本采集500ml 2~3小时内送检 涂抹样本采集 2~3支无菌棉签涂抹3~5只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔 2~3支无菌棉签涂抹食品或物品表面(地沟口,下水管口,水池壁涂抹,餐盘内外侧) 直接放入10ml碱胨水送检 ;; 动力试验 水样便:取一滴在玻片上,盖盖玻片,暗视野显微镜直接观察 成形便:取适量在生理盐水中研磨,盖盖玻片,镜下观察 高度可疑样本:取增菌的碱胨水在玻片上,盖盖玻片,镜下观察 镜下有穿梭样运动为动力试验阳性 动力抑制试验 取O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清,取适量标本在其中研磨 穿梭样运动消失,菌体凝集成块为动力抑制试验阳性 ; 增菌及分离培养 碱性蛋白胨水pH 8.8-9.0 注意标本和胨水的比例要适当 分离培养基分两类 选择性强的培养基 四号琼脂、TCBS、庆大培养基 选择性弱的培养基 碱性琼脂和碱性胆盐琼脂;霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐,由于亚碲酸钾的作用,菌落中央常呈灰色或灰黑色) ;;病人粪便标本; 菌株的初步鉴定 血清凝集试验 复核及鉴定 血清凝集试验 革兰氏染色 氧化酶试验 粘丝试验 动力试验; 菌株的初步鉴定 血清凝集试验 挑取可疑菌落与O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验,很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性(一般不超过10s) 注意:菌液浑浊,似凝非凝不能判定为阳性 同时做生理盐水对照 在1min内不出现凝集为阴性 结果可疑时需要做PCR鉴定; 菌株的复核及分型 血清凝集试验 用O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进行玻片凝集 O1群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集 结果分3种情况 同时做生理盐水对照; 菌株的复核及分型 氧化酶试验 弧菌属大部分为阳性,作为弧菌的简易辅助鉴定方法 用氧化酶试剂(1%盐酸二甲基对苯二胺)湿润滤纸 取营养琼脂

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