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霍乱实验室检技测术20110318
霍乱弧菌实验室检测技术;
霍乱的流行情况
霍乱的生物学性状
样本的采集
检验操作程序
荧光定量PCR方法检测O1群、 O139群霍乱弧菌及霍乱毒素
; 由O1群、 O139群霍乱弧菌引起的霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征,被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病,也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。;;;弧菌的分类
形态与染色
抗原结构、血清群
生长与培养特性
生化反应特性
对外界的抵抗力
药物敏感性;
弧菌的分类(包括5个属)
弧菌属
霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等
气单胞菌属
邻单胞菌属
发光菌属
水栖菌属
;
形态与染色
革兰氏染色阴性,两端钝圆或稍平
单鞭毛、鱼群样排列,菌体弯曲呈弧形或逗点状
暗视野显微镜下,霍乱弧菌运动活泼,呈穿梭状或流星状
培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润
;;;;
抗原结构、血清群
H抗原和O抗原
根据O抗原不同,分为200多个血清型
根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子和型特异性抗原因子
O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型
小川型含A、B抗原因子,也含少量C因子成分
稻叶型含A、 C因子
彦岛型含A、B、C因子;
生长与培养特性
好氧同时兼性厌氧,最适生长温度37℃
钠离子可刺激生长
耐碱不耐酸
初次分离时常用碱性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培养,
霍乱弧菌经6~8h增菌后可在液体表面大量繁殖,形成菌膜
;;
生化反应特性
两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖
产酸不产气
迟缓发酵乳糖,不分解阿拉伯糖
氧化酶试验
弧菌属细菌大多为阳性
粘丝实验
弧菌属细菌大多为阳性
;
对外界的抵抗力
在河、井、海水中可存活13周以上
食物和海产品上存活7天左右
对低温和碱耐受力强
(在食品上的弧菌于冰箱保存(0~5度)比室温存活时间长)
对热、干燥、太阳直射敏感
对含氯制剂、碘制剂敏感
对酸和强氧化剂极敏感
煮沸100度1~2min即可被杀死
药物敏感性
细菌带有可传递的耐药质粒
近年产生多重耐药株(丁胺卡那霉素 、强力霉素、复方新诺明 )
诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性 ;霍乱的致病性
主要毒素
霍乱肠毒素CT
小带联结毒素zot
辅助霍乱肠毒素ace
溶血素、溶细胞素、志贺样毒素
O139 群除具有上述 O1 群的致病物质外,还存在荚膜多糖和特殊 LPS 毒性决定簇,可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜 上。
;
腹泻患者样本采集
水样便采1~3ml,成形便取指甲大小量
肛拭子:生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内3~5cm处旋转取出
呕吐物采1~3ml
标本和碱胨水比例为1:5
水样及液体标本采集
采集相对静止表层水(30cm内)500ml
其他液体标本采集500ml
2~3小时内送检
涂抹样本采集
2~3支无菌棉签涂抹3~5只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔
2~3支无菌棉签涂抹食品或物品表面(地沟口,下水管口,水池壁涂抹,餐盘内外侧)
直接放入10ml碱胨水送检
;;
动力试验
水样便:取一滴在玻片上,盖盖玻片,暗视野显微镜直接观察
成形便:取适量在生理盐水中研磨,盖盖玻片,镜下观察
高度可疑样本:取增菌的碱胨水在玻片上,盖盖玻片,镜下观察
镜下有穿梭样运动为动力试验阳性
动力抑制试验
取O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清,取适量标本在其中研磨
穿梭样运动消失,菌体凝集成块为动力抑制试验阳性
;
增菌及分离培养
碱性蛋白胨水pH 8.8-9.0
注意标本和胨水的比例要适当
分离培养基分两类
选择性强的培养基
四号琼脂、TCBS、庆大培养基
选择性弱的培养基
碱性琼脂和碱性胆盐琼脂;霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐,由于亚碲酸钾的作用,菌落中央常呈灰色或灰黑色)
;;病人粪便标本;
菌株的初步鉴定
血清凝集试验
复核及鉴定
血清凝集试验
革兰氏染色
氧化酶试验
粘丝试验
动力试验;
菌株的初步鉴定
血清凝集试验
挑取可疑菌落与O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验,很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性(一般不超过10s)
注意:菌液浑浊,似凝非凝不能判定为阳性
同时做生理盐水对照
在1min内不出现凝集为阴性
结果可疑时需要做PCR鉴定;
菌株的复核及分型
血清凝集试验
用O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进行玻片凝集
O1群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集
结果分3种情况
同时做生理盐水对照;
菌株的复核及分型
氧化酶试验
弧菌属大部分为阳性,作为弧菌的简易辅助鉴定方法
用氧化酶试剂(1%盐酸二甲基对苯二胺)湿润滤纸
取营养琼脂
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