磷酸化westernblot经验.docxVIP

我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了。我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之western blot提出以下建议，供刚入门的同仁参考：1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。4.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。 6.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.7.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅. 做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有几点经验与大家分享：1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。2. 蛋白收集，洗涤贴壁细胞后，直接加1X上样缓冲液，超声后煮沸，不需要其他的磷酸酶抑制剂，效果不错。简单容易操作，适合新手。3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。 磷酸化抗体当然不能使用脱脂奶，因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。 但多肽序列特异的磷酸化抗体一半不受脱脂奶的影响。。双磷酸化MAPK （such as ERK1/2, JNKs, p38 MAPK)抗体很少受脱脂奶影响。信号变弱是因为脱脂奶可能会影响抗体进入固定于膜上的抗原而已。4度过夜好，主要原因不是抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。 蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而但抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体抗原浓度却是动力学范畴。 膜上的抗原脱落了，结合效率会低。