人B细胞连接蛋白（BLNK）酶联免疫分析（ELISA）.doc

人B细胞连接蛋白(BLNK)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人B细胞连接蛋白(BLNK)含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人B细胞连接蛋白(BLNK)水平。用纯化的人B细胞连接蛋白(BLNK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入B细胞连接蛋白(BLNK)，再与HRP 标记的B细胞连接蛋白(BLNK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的B细胞连接蛋白(BLNK)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人B细胞连接蛋白(BLNK)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存 说明书 1份 1份 ? 封板膜 2片(48) 2片(96) ? 密封袋 1个 1个 ? 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存 标准品0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存 酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存 浓缩洗涤液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存 1.血清：室温血液自然凝固10-20 分钟，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 操作步骤： 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝