大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定.ppt

大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 ----312 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 一、实验目的 1.掌握鉴别大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的方法。 2.学习并掌握革兰氏染色法。 3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 二、基本原理 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。在普通培养基上形成圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起菌落。 沙门氏菌是革兰氏阴性菌，（0.7～1.5μm）×（2～5μm）散在，无荚膜和芽孢，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 二、基本原理 在普通琼脂培养基上生长良好，培养24h后，形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征亦与大肠杆菌相似。 克雷柏氏菌为较短粗的杆菌，革兰氏阴性菌，大小0.5～0.8×1～2um,单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 二、基本原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法 通过把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色 ； 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 二、基本原理 而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 三、器材与试剂 1、器材 超净工作台、接种环、酒精灯、火柴、试管架、显微镜、擦镜纸、双层瓶、装有蒸馏水的滴瓶等 2、试剂 大肠杆菌、沙门氏菌、克雷柏氏菌24h的牛肉膏琼脂斜面培养物 革兰氏染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液等） 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 四、实验步骤 1、观察菌落形态 进行初步鉴定 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 四、实验步骤 2、革兰氏染色 1）制片 取活跃生长期的菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。 2）初染 滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，水洗至流出水无色。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 四、实验步骤 3）媒染 接下来用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。 4）脱色 将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般20~30s），当流出液无色时立即用水洗去乙醇。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 四、实验步骤 5）复染 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。 6）镜检 油镜观察。 7）混合涂片染色 在载玻片同一区域用大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌混合涂片，其他步骤同上。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 四、实验步骤 3、在光学显微镜下观察形态。 大肠杆菌、沙门氏菌及克雷柏氏菌的微生物学鉴定 五、预期实验结果 a）大肠杆菌：大肠杆菌为革兰氏阴性菌，中等大小，两端略圆的短粗杆菌，成单个存在，也有成双排列；周身鞭毛，能运动，有时两端着色较浓，要注意与巴氏杆菌区分开来 b）沙门氏菌：沙门氏菌也为革兰氏阴性菌，无芽孢，大小通。常为0.7~1.5um*2.0~5.0um，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌