RT-PCR技术原理、步骤与注意事项.PDF

  1. 1、本文档共12页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
RT-PCR技术原理、步骤与注意事项

RT-PCR 技术原理、步骤与注意事项 RT-PCR 简介 RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA 。 RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。(检 测基因表达的方法,参见 Northern Blot 法。) RT-PCR 有时候也会指代实时 PCR(real-time PCR) 。为了与逆转录PCR 相区别, 通常被写作“定量 PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR) 。 实时 PCR 实时 PCR(real-time PCR) ,属于定量PCR (Q-PCR )的一种,以一定时间内DNA 的增幅量为基础进行DNA 的定量分析。 real time PCR 的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在ds DNA (双 链 DNA )中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅DNA 序列中特定寡核酸 序列相结合的一种萤光探针(probe )。 real time PCR 与 reverse transcription PCR (反转录PCR) )相结合,能用微量的 RNA 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种 RT PCR 的组 合又被称之为“定量 RT-PCR (quantitative RT-PCR )” RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体,相当于 mRNA 引物 AMV (M-MLV ):逆转录酶 dNTP:脱氧核苷酸 RNase :RNA 酶抑制剂 PCR Buffer :RT-PCR 缓冲液 MgCl2 :2 价镁离子 PCR 各步骤的目的 (一)预变性: 破坏DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA 充分变性,减少DNA 复 杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的 DNA 模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动 Taq 酶的反应中,还可激 活 Taq 酶,从而使 PCR 反应得以顺利进行。 (二)变性--退火--延伸循环: ①模板 DNA 的变性:模板DNA 经加热至 93 ℃左右一定时间后,使模板 DNA 双 链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下 轮反应作准备; ②模板 DNA 与引物的退火(复性) :模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55 ℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸:DNA 模板-- 引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为 反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模 板 DNA 链互补的半保留复制链。 (三)PCR 仪扩增循环后 72 度延伸 10 分钟 用PCR 仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72 度延伸了 10 分钟的原因: 1.延伸时间取决于待扩增 DNA 片段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下) 例如,使用 taqDNA 聚合酶,72 度时的碱基掺入率为 35-100bp/s,因此延伸速率为 1kb/min。 2.根据延伸速率推得,扩增 1kb 以内的dna 片段 1min 即可,而3-4kb 则需要 3-4min ,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-10min,这样做是 使 pcr 反应完全以提高扩增产量。 3.继续 72 度延伸了 10 分钟除了可以使 pcr 反应完全以提高扩增产量外,还有 一个作用是:在用普通 taq 酶进行 PCR 扩增时在产物末端加 A 尾的作用,可以直接 用于 TA 克隆的进行。 RT-PCR 的注意事项 在做Northern 等杂交实验、构建Cdna(互补DNA)文库、获取能够编码真核生物蛋白 的基因、获得RNA 病毒基因时,会用到RNA 提取和RT-PCR 技术。 真核生物的基因组是DNA,为什么不直接从DNA PCR 得到我们需要的基因呢?因为 真核生物的基因含有大量的非编码区,称为内元(intron),真正编码蛋白的区段是被这些 内元隔开的,这些编码区叫做外元(ex

您可能关注的文档

文档评论(0)

***** + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

版权声明书
用户编号:8010045112000002

1亿VIP精品文档

相关文档