SDS缓冲液制备.docVIP

SDS的试剂配置： 浓缩胶缓冲液——1.0M pH 6.8的Tris-Hcl溶液：称取12.11g Tris置于100ml 的容量瓶中，加入约80ml 去离子水，充分搅拌溶解；用盐酸调节pH值至6.8后，将溶液定容，室温下保存备用。 分离胶缓冲溶液——1.5M pH 8.8的Tris-Hcl溶液：称取18.17g Tris于100ml的容量瓶中，加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解；用盐酸调节至8.8后，将溶液定容保存。 SDS上样缓冲液：取0.063ml pH 6.8的Tris-Hcl缓冲液与5ml的容量瓶中，依次加入0.1g十二烷基环酸钠SDS、5.0mg溴酚蓝BPB和0.5ml甘油；加入适量去离子水搅拌溶解后，定容至 5 ml；小份（1 ml/份）分装后，在-20℃下保存备用。 SDS电泳缓冲液：称取 3.02g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）于 1 L 的容量瓶中，加入 18.8 g 甘氨酸（Glycine）和 1.0 g SDS；加去离子水溶解并混合均匀后，定容至 1 L，室温下保存备用。 30%丙烯酰胺溶液：称取 29.0 g 丙烯酰胺（Acr）和 1.0 N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）于 100 ml 棕色的容量瓶中，加去离子水溶解并混匀后定容，放置于 4℃下保存备用。 10%（W/V）SDS 溶液：称取 10.0 g SDS 于 100 ml 的容量瓶中，加入约 80 ml 去离子水；在 68 ℃的水浴中加热溶解，自然冷却至室温；加去离子水定容并，室温下保存备用。 10% （W/V）APS 溶液：称取 0.1g 过硫酸铵（APS），置于 1.5 ml 离心管中，加去离子水 1 ml 溶解即可；4℃保存备用。 考马斯亮蓝染色液：称取 0.5 g 考马斯亮蓝R 250 于500ml 的容量瓶中，加入约 225 ml 甲醇和 50 ml 乙酸；充分搅拌溶解后，加入去离子水定容，室温下保存备用。 脱色液：分别量取 50 ml 甲醇和 50 ml 乙酸，置于 500 ml 的容量瓶中混合均匀；加入去离子水定容，室温下保存备用。 取待测蛋白样品 30μl，并加入30μl SDS上样缓冲液，将混合物振荡摇匀后置于100℃的水中煮5min，之后以12000r/min 离心1 min后备用。蛋白质分子量标准（Marker）采用同样的方法处理后作为参照物备用。 实验 （a）配制 10 ml 15% 的分离胶（现配现用）：将 2.3 ml 去离子水、5.0ml 30%丙烯酰胺溶液、2.5 ml 分离胶缓冲液、0.1 ml 10% SDS溶液和 0.1 ml 10% APS 溶液置于烧杯中混合均匀；加入 0.008 ml N′, N′-四甲基乙二胺（TEMED），迅速摇匀。 （b）分离胶的聚合：迅速将配好的分离胶加入制胶槽中，注意应沿着边缘缓慢加入，以免气泡进入；凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳子齿0.5 cm处时，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水（或正丁醇）封胶，使凝胶表面变得平整；静置0.5-1 h，使凝胶聚合；待凝胶聚合后，稍微倾斜模具，除去上面的水层，并用滤纸吸 尽残留的液体。 （c）配制 3 ml 5% 的浓缩胶（现配现用）：将 2.1 ml 去离子水、0.5 ml 30%丙烯酰胺溶液、0.38 ml 浓缩胶缓冲液、0.03 ml 10% SDS溶液和 0.03ml 10% APS 溶液置于烧杯中混合均匀；加入 0.006 ml TEMED，迅速摇匀。 （d）浓缩胶的聚合：迅速将配好的浓缩胶添加到聚合后的分离胶上面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐，小心避免混入气泡；静置 0.5-1h，使凝胶聚合。 （e） 加样孔的制备：将胶板放入电泳槽中，在上下电泳槽中添加电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中；轻轻拔出梳子，注意不要将加样孔撕破。 （f）加样及电泳：分别取 10 μl 蛋白 Marker 和样品，分别加至电泳槽的加样孔底部，避免带入气泡；接通电源，上槽（加样孔端）接负极，下槽接正极；调节电压至74V，待溴酚蓝前沿进入分离胶时，增加电压至 105V；电泳大约需要 1.5-2 h，待溴酚蓝刚刚跑出分离胶的底部时，切断电源，从电极上拔掉电极插头，取出玻璃板。 （g）凝胶板的剥离：戴上手套，小心移去两玻璃板之间的隔片；利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板，小心从制胶板上将凝胶剥下，弃去浓缩胶；在右上角切去小片作为定位标记。 （h)染色及脱色：用清水洗胶，将分离胶放入染色液中缓慢摇动，染色约 30min。从染色液中将凝胶取出用水漂洗后，将胶放入脱色液中进行扩散脱色，直到背景蓝色褪淡，见到条带。根据具体情况，大约需要换 3-5次