大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备.docVIP

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 【实验目的】 掌握用 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 【实验原理】 常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。 受体细胞经一定方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。 【材料和试剂】 DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl2溶液、75%的甘油（以上试剂均需高压灭菌） 【仪器设备】 振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等 【实验步骤】 1、 将 1ml新鲜的16h过夜培养物，转到 100ml LB培养基中。于 37℃ 振荡摇匀 3h（旋转摇床200～300r/min），测量 OD600nm=0.314。 2、 在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中，在冰上放置10min。 3、 于 4℃用 4000r/min 离心10min。 4、 弃去上清液，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留培养液流尽。 5、 各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl2溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min。 6、 于4℃用 4000r/min离心 10min。 7、 弃上清，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留的痕量培养液流尽。 8、 先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，再加入 25μL预冷的75% 的甘油，之后于 -80℃贮存备用。 【注意事项】 1、 制备过程均需在低温（4℃）下进行，应尽量避免处理的细胞升温或于室温放置过久，否则会严重影响感受态细胞制备的效果。 2、 操作过程需保证无菌状态，若不慎污染，则后续操作将无法正常进行。