分子生物学讨论课.pptx

;蛋白质双向电泳的原理、方法及应用;;Western Blot的原理;2.基本原理;直接法;Western Blot的操作流程;蛋白质 样品制备;?依次在电泳转移槽正极板上铺两 层正极缓冲液Ⅰ湿滤纸，一层正极缓冲液Ⅱ湿滤纸，膜，凝胶，三层负极缓冲液湿滤纸。 ?在膜上做好标记以便定位，并驱逐每层间的气泡。 ?盖上负极板，接通电源，进行转移。 ;封闭;底 物 显 色;Western Blot的操作流程;Western Blot的应用;1.Western Blot法诊断囊虫病;免疫学实验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。 运用DNA重组技术，构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库，以囊虫病患者及病猪血清为抗体，从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）。这些抗原克隆经IPTG诱导，形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白。 采用简化Western blot法，以等比混合的四种融合蛋白为抗原测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体;Western印迹分析检测STAT3表达 荧光定量PCR检测STAT3mRNA的表达;3.Western Blot法测定风疹病毒特异性抗原;可采用Western Blot的方法，测定风疹病毒的主要抗原性蛋白，以指导临床应用。;;;;等电聚焦电泳;双向电泳（2DE）示意图;硝酸银染色图谱;原理;DIGE图谱;取叶片200mg加少许石英砂于液氮中研成粉末悬浮于3ml可溶性蛋白抽提液中，4℃放置1小时以上； 4℃，15000r/min条件离心15min，取上清液按1:4与冷丙酮混合，-20℃放置3小时以上或过夜； 15000r/min条件离心15min，取沉淀，用80%丙酮洗两次； 15000r/min条件离心15min，真空干燥溶于400ul混合液中； 15000r/min条件离心15min，取上清上样。;（1）玻管的准备：取内径1.5～2mm，长16cm玻管，用乙醇:盐酸为6:4的溶液浸泡30min再用蒸馏水冲洗，烘干。灌胶前用封口膜封住管的一端，固定。 （2）凝胶的配制与等电聚焦：取尿素2.06g，加入0.75ml蒸馏水，0.75ml 10%的NP-40，37℃水浴，待尿素充分溶解后加入0.5ml的凝胶原液和两性电解质0.05mlpH3.5～10、0.05ml pH4～6、0.15mlpH6～8，再加入10μl 10%l AP和3μl TEMED，混匀后灌胶。在灌好的胶管的顶部覆盖1cm的双蒸水，室温聚合1小时以上，待胶聚合好后吸去上层水溶液加样30μl，再加入20μl样品覆盖液和50mmol/LNaOH至管口，待电泳。 ;聚焦结束后，取出玻管，吸去两端的溶液并以双蒸水清洗，然后用10ml注射器套上200μl的tip头吸取一些水从进样的一端轻轻将胶条打出； 将要测定的胶条按每段1cm分成若干段后，按顺序装入盛有脱气的双蒸水的小瓶中，放4℃冰箱过夜，次日用pH计分别测定各段的pH值； 对要进行第二向SDS的胶条则必须放入平衡液[60mmol/LTris-Cl pH6.8，2%SDS，5%2-巯基乙醇，10%甘油，0.05%溴酚蓝]中平衡10～30min（平衡后的胶条酸端染成淡绿色而碱端染成深蓝色）； 暂不进行第二向电泳的胶条可放入-20℃保存数日。;选用DDY-Ⅲ28D型电泳槽，分离胶浓度13%，浓缩胶浓度5%，分离胶长160mm，浓缩胶长40mm（灌至玻板上沿），灌好浓缩胶后在一端插入单孔梳，以便加入蛋白质分子量标准品。 待胶聚合后，将第一向平衡好的胶条平放于浓缩胶顶部（避免胶条拉伸）并用1%琼脂糖（用电极缓冲液配制）封胶。此时应注意避免胶条与浓缩胶上沿之间产生气泡。 待琼脂糖凝固后拔出单孔梳，加入适量按变性胶处理过的marker，加满电极缓冲液，4℃冰箱电泳，恒压200V，至溴酚蓝达胶底部为止（约5h）;染色与脱色;32;1.人类疾病的蛋白质组研究;;;;第一代测序技术;第二代测序技术;第三代测序技术;双脱氧核苷酸末端终止测序法;主要步骤： 1.单链DNA模板的制备 2.DNA模板与测序引物退火 3.掺入法标记反应 4.延伸--终止反应 5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.放射自显影 7.阅读测序结果; 1.单链DNA模板的制备 双链DNA如质粒、染色体DNA、或PCR产物等——用强碱处理，使双链变性解链。 单链DNA如M13噬菌体等——省去变性处理过程 2.DNA模板与测序引物退火 制备好的引物和模板在适当缓冲体系中混合，68℃加热2分钟，缓慢冷却至30℃左右，测序引物会结合到模板相应位置上去。 ;3.掺入法标记反应 退火后加入DNA聚合酶、4种底物及适当的反应缓冲液，其中一种底物带放射性核素的标记，于25℃反应2~3分钟。每条测序