支气管肺泡灌洗(BAL) 操作方法：要领.doc

支气管肺泡灌洗(BAL) 操作方法：一、术前准备同纤维支气管镜(纤支镜) 术前准备,常规在纤支镜气道检查后于活检刷检前做BAL。局部麻醉剂为2 %利多卡因。二、BAL 操作技术1.灌洗部位选择:对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B1或B5 ) 或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行BAL2. BAL 操作步骤首先在要灌洗的肺段经活检孔通过一细硅管注入2 %利多卡因1～2ml ,做灌洗肺段局部麻醉然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处,再经活检孔通过硅胶管快速注入37 灭菌生理盐水,每次25～50ml ,总量100～250ml ,一般不超过300ml立即用50 ～100mmHg(1mmHg = 0. 133kPa) 负压吸引回收灌洗液, 通常回收率为40 %～60 %将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液,并记录总量装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附) ,置于含有冰块的保温瓶中,立即送往实验室检查支气管肺泡灌洗液(BALF) 实验室检查一、BALF 细胞总数和分类计数检测1.将上述回收灌洗液装入塑料离心管内, 在4 下以1 200r/ min 离心10min ,上清(原液或10 倍浓缩) - 70 储存,用做可溶性成分的检测。2. 经离心沉淀的细胞成分用Hank’s液(不含Ca2+ 、Mg2+ ) 在同样条件离心冲洗2 次, 每次5min。弃去上清后Hank’s 液3～5 ml 制成细胞悬液。也可以应用灌洗原液以减少细胞丢失3. 在改良的Neubauer 计数台上计数BALF 中细胞总数,一般以1 ×109/ L表示。如果细胞数过高时,再用Hank’s液稀释,调整细胞数为5 ×109/ L ,并同时将试管浸入碎冰块中备用4. 细胞分类计数:采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5 ×109/ L) 100μl ,在4 下以1 200 r/min 离心10 min通过离心作用将一定数量的BALF 细胞直接平于载玻片上。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30 min 后进行染色,一般用Wright 或HE 染色RPMI 1640 培养液3～5ml 制成细胞悬液2. 将细胞悬液倒人平皿中,置于37 5 %CO2 培养箱中孵育2h ,进行贴壁处理,去除肺泡巨噬细胞3. 取出细胞悬液,再用Hank’s 液冲洗离心1 次,弃上清留20～100μl 。经贴壁处理后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少,淋巴细胞相对增多4. 将经贴壁处理的细胞悬液分装3个小锥 形离心管内,每管20～30μl ,用微量加样器向标本中加单克隆抗体CD3 ,CD4 和CD8 各20～40μl ,混匀置于4 冰箱中作用1～2h5. 取出标本,先用Hank’s 液冲洗离心2 次,以12 000 r/ min 离心20s ,然后加羊抗鼠荧光抗体各20～40μl ,置于4 冰箱作用30min。6. 取出标本用Hank’s 液以同样速度和时间离心冲洗2 次,弃上清留20μl充分混匀细胞,取1 滴于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数200 个淋巴细胞并计算出标有荧光细胞的阳性率几点说明1. 用于做支气管肺泡灌洗的纤支镜顶端直径应在5. 5～6. 0mm 左右,适于紧密楔人段或亚段支气管管口,防止大气道分泌物混入和灌洗液外溢,保证BALF 回收量2. 在灌洗过程中咳嗽反射必须得到充分的抑制,否则易引起支气管壁粘膜损伤而造成灌洗液的混血,同时影响回收量3. 一份合格的BALF 标本应是:BALF 中没有大气道分泌物混入;回收率> 40 % ,存活细胞占95 %以上;红细胞< 10 %(除外创伤/ 出血因素) ,上皮细胞< 3 %～5 %;涂片细胞形态完整,无变形,分布均匀4. 由于BALF 中可溶性成分检测受诸多检测因素影响,如灌注量和回收量、肺泡上皮通透性等,致使肺泡衬液稀释度亦有所不同。尽管在做BALF 可溶性成分检测时采用内或外标记物进行标化,但检测结果仍存在着差异,其 临床价值有限, 故本草案未做有关BALF 液性成分检测方法的规范5. 本规范不适于少量液体做支气管冲洗(BL) 和全肺灌洗技术的操作。6. 健康非吸烟者BALF 细胞学检测正常参考值: (1) 细胞总分数:细胞总数(0. 9～0. 26) ×109/ L ,其中肺泡巨噬细胞0. 93 ±0. 03 ,淋巴细胞0. 07 ±0. 01 ,中性和嗜酸细胞均< 0. 01。(2) T 淋巴细胞亚群:总T细胞(CD3+ ) 0. 7 ,T辅助细胞(CD4+ ) 0. 5 ,T 抑制细胞(CD8 + ) 0.3 ,CD4+ / CD8+ 比值1. 5～1. 8第二节　支气管肺泡灌洗液检查 　　痰液检查虽可对