第九章 因功能研究常用方法.ppt

重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 第二节 转基因技术与核转移技术 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物 一、转基因技术 转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。 转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是“分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达” 转基因动物构建过程 转基因载体的构建 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中 对转基因动物进行鉴定 转基因的技术方法 DNA显微注射法 克隆法 胚胎干细胞技术 逆转录病毒介导的基因转移 精子载体法等 各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法 转基因动物的鉴定 Southern杂交 确定外源基因的整合以及整合的拷贝数 RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达情况 实时PCR（荧光定量PCR） 转基因技术的应用 （1）建立致病基因表达、调控的动物模型 （2）动植物新品种的培育 （3）各种基因工程产品的制备 （4）探讨生殖细胞的基因治疗方法 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体,为无性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件 二、核转移技术 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? 克隆羊“多利” 基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 第三节、基因剔除技术 基因剔除程序 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚. 细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠. 基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制 ① 单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活. 单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等 ② 多基因决定疾病模型 多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病 第四节 基因沉默技术 基因沉默技术 反义(antisen)技术 RNA干涉(RNA Interference,RNAi) 反义技术 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子