分子生物学第五章dna分子基本操作技术.ppt

rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。 3、RNA的完整性 * 二、 mRNA的纯化 绝大多数真核生物细胞mRNA的3′端存在聚腺苷酸组成的Poly（A+）尾，这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志。 * 寡聚（dT）-纤维素柱层析法 免疫磁珠法 mRNA的纯化方法 * 寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA 3′端含有Poly（A+）尾巴 的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 原理 寡聚（dT）-纤维素柱层析法 * 用纤维素柱纯化具poly(A)尾-mRNA的流程示意图 免疫磁珠法原理 * * 三、 cDNA的合成 使用Oligo dT Primer时的cDNA合成 使用Random Primer时的cDNA合成 * 使用Oligo dT Primer时的cDNA合成 缺陷：不具有ploy（A）尾结构的mRNA无法使用此方法！ * 使用Random Primer时的cDNA合成 缺陷：cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3′-末端的oligo(dT)引物一处开始。 以构建cDNA文库为目的的cDNA合成 ------定向cDNA合成及分子修饰 * mRNA反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物RP，以保证得到全长cDNA； 选用活性较高的反转录酶； 合成的cDNA的方向性及甲基化dNTPs 的选用。 定向cDNA合成及分子修饰的注意事项： * 四、cDNA文库的构建 cDNA文库的载体选择要根据该文库的用途来确定，例如常用的Uni-zap XR载体是一种λ噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳10kb DNA插入片段。 * 以λ噬菌体构建cDNA文库的流程图 体外包装反应的实验室条件要求非常精确，DNA和蛋白提取物的浓度、两者的体积比、反应温度及时间对包装效果都有很大影响，而包装结果的好坏对重组噬菌体的侵染力有重要的影响。 * 五、文库的筛选 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法 * 核酸杂交法 以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。 * * PCR筛选法 菌落PCR筛选法 文库PCR筛选法 前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。具有操作简单、快捷等特点。 * PCR筛选法 将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。 菌落PCR筛选法 * 文库PCR筛选法 * 1.该种方法适用于表达文库的筛选。 2.必须有针对基因产物的特异性抗体，才能用免疫学方法筛选。 免疫筛选法 * 第七节 基因克隆 一、基因克隆的策略 二、基因克隆技术 * 克隆 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 * 一、克隆基因的策略 1.如何克隆已知基因 2.如何克隆同源基因 3. 已获得未知蛋白, 如何克隆其基因 4. 转座子标签法克隆基因 5.定位克隆(positional cloning) 6.差减杂交法（subtructive hybridization cloning) * 1. 如何克隆已知基因 （1）如果该基因为连续基因，没有内含子，以基因组DNA为模板 如果该基因为断裂基因，有内含子，提取总RNA（包括了mRNA）,以此为模板 原核基因一般没有内含子 （2）设计上下游引物，进行PCR反应 （3）电泳回收PCR产物 （4）与载体连接、测序、转化宿主进行表达 * 科研举例 试克隆萤火虫的荧光素酶(luciferase)基因，并在竹子中表达 1）确定该基因是否有内含子，若无，以其基因组DNA为模板；若有