丹参通络解毒汤对骨髓干细胞移植急性心肌梗死模型大鼠炎症反应影响.docVIP

丹参通络解毒汤对骨髓干细胞移植急性心肌梗死模型大鼠炎症反应的影响 　　摘要：目的 观察丹参通络解毒汤对骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植急性心肌梗死（AMI）模型大鼠炎症反应的影响，探讨其作用机制。方法 采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离、培养BMSCs。结扎冠状动脉左前降支建立AMI模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs组，每组10只。BMSCs细胞悬液直接注入梗死区边缘心肌组织；各组大鼠给予相应药物或生理盐水灌胃。4周后，ELISA测定大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、可溶性细胞间黏附因子-1（sICAM-1）含量，Western blot测定心肌组织Toll样受体4（TLR-4）蛋白表达，HE染色观察心肌组织病理形态。结果 与模型组比较，BMSCs组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs组大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量及心肌组织TLR-4蛋白表达均显著降低（P 　　Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致残率逐年增高，成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。近年来骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、体外扩增能力强、可来源于自身、应用于临床的可行性高等优势[1]，成为治疗AMI新途径研究的热点。研究显示，BMSCs的应用可促进心肌组织细胞再生，刺激梗死区毛细血管新生，调节梗死区域心肌组织细胞的凋亡，改善心脏功能[2]。同时，有实验研究表明，中药干预BMSCs可调控BMSCs的归巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，为BMSCs移植提供良好微环境[3]。丹参通络解毒汤由丹参、水蛭、玄参、黄连等配伍组成，全方具有益气活血、通络解毒功效，临床治疗冠心病疗效显著[4]。为研究该方对AMI后大鼠的抗炎作用，本实验通过结扎冠状动脉左前降支的方法构建AMI大鼠模型，观察丹参通络解毒汤对大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、可溶性细胞间黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌组织Toll样受体4（TLR-4）蛋白表达的影响，探讨其作用机制 1 实验材料 1.1 动物 10～12周龄清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±30）g，用于移植；4～6周幼龄大鼠20只，雌雄各半，体质量（100±10）g，湖南中医药大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通饲料饲养，自由饮食，12 h/ 12 h明暗环境交替 1.2 药物 丹参通络解毒汤（丹参15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，当归15 g，红花10 g，玄参15 g，黄芩10 g，栀子15 g，黄连6 g，黄芪30 g等），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，由该院制剂室煎煮，浓缩至含原药材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存备用 1.3 主要试剂与仪器 MCP-1、sICAM-1 ELISA试剂盒、TLR-4单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP标记二抗，上海碧云天生物技术有限公司。SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；Galaxy型CO2培养箱，英国New Brunswick公司；倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯；多导生理信号采集系统，成都仪器厂；DW-2000型动物人工呼吸机，上海嘉鹏科技有限公司；mini protean 3 cell型电泳仪，BIO-RAD公司 2 实验方法 2.1 骨髓间充质干细胞制备和培养 从4～6周清洁级雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集细胞，采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法进行分离、培养。经多次换液和消化，将传至P3的BMSCs采用流式细胞仪检查细胞表面抗原，以CD34阳性率低于5%及CD90、CD44阳性率高于95%鉴定所得细胞为高纯度的BMSCs 2.2 造模 参照文献[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，气管插管连接小动物呼吸机，开胸暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳右缘之间交点和心尖的假想连线中下1/3处穿线结扎。以心电图出现QRS波群增高增宽伴ST段抬高、心肌组织颜色发绀为结扎成功；以结扎部位以下心肌组织搏动减弱、颜色变苍白，及心电图显示肢体Ⅱ导联R波振幅升高、QRS波改变、J点偏移