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天然活性小分子靶标蛋白识别方法学研究进展 　　[摘要]药物靶标是指人体内与药物相互作用并赋予药物效应的特定分子。作为传统中药的药效物质基础，天然活性小分子的作用机制阐明，特别是作用靶标的鉴定一直是药学研究者关注的重要课题，然而目前该领域一直未取得长足的进展。作者针对近年来在天然活性小分子靶标蛋白识别鉴定方面出现的新技术、新方法进行了总结，系统介绍了目前该领域的主流研究方法，原理以及成功案例，同时还探讨了每种方法的适用性及不同方法之间的优劣。相信该文对从事天然药物化学、药理学以及化学生物学领域的研究人员有一定的启发和借鉴作用 [关键词]天然活性小分子；靶标蛋白；方法学；分子亲和色谱；活性蛋白质谱 天然活性小分子是新药研发的重要来源，目前有相当比例的临床用药都直接或间接来源于天然药物。然而，以往针对天然活性分子的活性研究大多集中在细胞表型变化的观测及初步的药效学指标评价上，即使是分子机制研究也大多仅关注一些经典的药理信号通路，往往忽略这些活性分子直接作用靶标的鉴定。主要原因可能在于天然活性分子的结构多样性和复杂性。例如不同科属、不同地域生长的药用植物性状差别很大，导致其所含有的活性化学成分多种多样，结构更是千差万别。由于化合物的结构直接决定着其药理活性作用，而天然活性分子的结构如此复杂，因此其可能作用的蛋白靶标非常繁多，即使是一个活性分子也可能同时作用于多个蛋白靶标，鉴定工作非常具有挑战性。另外一个原因就是天然活性分子中很大一部分化合物的结构含有多个活性位点，也就是说其中包含了多个可以成为药效团的亚结构，因此到底是哪一部分发挥了药效，其与靶标蛋白是如何作用的？这些问题均难以得到解答，或至少在技术上存在相当的难度，因此这也是制约天然活性分子靶标蛋白阐明工作的一个障碍 目前，在探索天然活性分子的靶标蛋白方面，前人已经积累了一些经验，在此该文就当前主流的天然活性分子靶标蛋白鉴定工作进行了总结和分类，旨在为今后该领域的研究提供一些技术和方法上的借鉴。就目前的研究进展来看，天然活性小分子的靶标蛋白识别主要采用如下一些方法，各种方法互有优劣，可相互借鉴，也可综合运用。①基于分子亲和色谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白（化学蛋白质组学）；②基于活性蛋白质谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白；③基于活性小分子结构的计算机辅助反向寻靶技术；④基于生物物理学方法推测天然活性小分子靶标蛋白；⑤基于关键疾病信号通路识别天然活性小分子靶标蛋白；⑥其他新方法 下面就分别对这些方法的原理和应用进行详细的论述和分析 1基于分子亲和色谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白（化学蛋白质组学） 在目前所采用的各种靶标蛋白识别技术中，小分子亲和色谱法（small molecule affinity chromatography）是应用最为广泛的一种。目前应用该法已经识别并鉴定了包括天然活性分子在内的大量药物分子的靶标蛋白。目前的小分子亲和色谱法一般需要对活性小分子的结构进行修饰，通过化学手段引入标签分子进而将其连接到免疫亲和载体上，并进行靶标蛋白的富集和识别。标签分子主要是biotin，此外还包括荧光基团、化学反应基团、光反应基团、放射性同位素等。下面分别进行具体的介绍 1.1通过引入biotin标签分子构建天然活性小分子免疫亲和载体biotin是一种相对分子质量为244的生物小分子，广泛分布于动植物体内。在生物学研究中，人们常利用hio-tin与avidin（亲和素）之间的稳定结合能力，对蛋白质及其他生物大分子进行标记和纯化富集等操作。目前已经发展出了一套十分成熟的biotin-avidin系统（BAS）用于活性小分子的靶标蛋白富集和识别。即通过将biotin与活性小分子进行化学共价键连接进而构建一种biotin修饰的活性小分子探针，并用于后续的靶标蛋白识别研究。该方法的优势在于，biotin与avidin之间存在天然的特异性强相互作用，因此利用avidin包被的琼脂糖（agarose）固相载体与biotin修饰的天然活性小分子之间进行反应，利用biotin与avidin的相互作用将活性小分子固定并包被在固相载体上，进而再通过活性小分子与蛋白之间的相互作用，富集和纯化到相应的靶标蛋白（图1） 由于该法易于操作、适用面广，因此研究人员采用该法已经富集并识别到了一批新颖的药物靶标蛋白。陈国强教授课题组针对天然活性分子腺花素（adenanthin）治疗早幼粒白血病的靶标蛋白开展了深入研究，其利用腺花素分子结构中的活性羟基基团作为把手，通过在其上连接长链的biotin分子基团进而构建了biotin化腺花素探针分子（bio-adenan-thin），并据此富集到了相应的靶标蛋白为过氧化物酶（perox-iredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ