6实验六DNSCI法分析蛋白质的N末端氨基酸.pptxVIP

实验九 丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸 刘德立 2005. 6 一、实验原理 蛋白质N-末端分析的方法主要有二硝基氟苯（DNFB） 法、丹磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法和氨肽酶法等。 DNFB法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 DNS法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与蛋白质N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氯-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol，灵敏度比DNFB法高100倍。 蛋白质的α -氨基与丹磺酰氯反应，生成DNS-蛋白质，经水解生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质N-末端氨基酸。 聚酰胺薄膜展层时，展层剂与被分离物在聚酰胺薄膜表面竞争形成氢键，键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。因此，选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸咐— 解吸咐— 再吸咐 — 再解吸咐的连续过程，达到分离的目的。 二 实验器材及试剂 1 标准氨基酸（甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸，丙氨酸，组氨酸）。 2 未知蛋白质样品。