PCRRT-PCR常见问题及分析.pptxVIP

PCR常见问题分析及解决方案;PCR技术的发明;pcr动画.exe;;PCR标准反应体系;;反应体系对PCR扩增的影响;如何选择最合适的DNA聚合酶;1 Taq酶——扩增效率最高;2 pfu酶——保真度高 ;3 HotStart Taq酶——特异性高;4 混合酶——高扩增效率＋高保真度;根据PCR实验的不同需求;预配的PCR反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 ;特 点;PCR常见问题分析;PCR常见问题;问题1：无扩增产物;纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构 ;引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好;退火温度 延伸时间 循环次数; ;引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多; 靶序列或扩增产物 的交叉污染 ;提高PCR特异性的策略; ;策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） ; ; ;甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等 可能???机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当 ;RT-PCR简介;主要内容;两步法RT-PCR;;两步法与一步法RT-PCR比较; 分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针;逆