分子生物学实验(生技生科)下游-2017.ppt

镍柱纯化实验流程 一．上清液测活 二．Ni柱纯化步骤： 装柱:清洗玻璃柱，连接好橡皮管，将层析柱安装到铁架台上向柱内加入1-2ml 蒸馏水，再加1-2ml 镍柱介质（助教完成） 平衡:先用水15-20ml洗介质,再用5-10ml 平衡液（实验台上20mM Tris pH8.0）平衡柱子(流速慢!)。平衡液沿柱内壁缓慢加入 上样:取3ml上清液上样，上样过程中的穿出夜收集起来，再重新上样，如此循环3次！（流穿液测活） 洗涤:上样完成之后，用3-5ml洗涤液（实验台上10mM Tris pH8，50mM 咪唑）洗去没有结合的蛋白（洗涤液测活） 洗脱:用3ml洗脱液（实验台上10mM Tris pH8，300mM 咪唑）洗脱目标蛋白。1ml/管，收集3-5管。各管洗脱液测活。 三．复性液测活 各样品测活、测蛋白稀释倍数及加样量参考表 待测液测酶活 DEAE离子交换:上清液上样稀释500-1000倍 复性液:直接测活 DEAE洗脱合并液: Ni-NTA上清液:稀释250-500倍测活 实验操作 第4-5次：对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析/ /Western bloting ， 绘出分离纯化表 实验顺序：蛋白电泳，同时进行数据分析 涉及单元实验：蛋白电泳 掌握要点：掌握蛋白电泳方法及/Western bloting 了解分离纯化样品纯度鉴定的各种方法 绘制酶的分离纯化表 1.?包涵体复性上样液 2.?上清上样液（Ni柱沉淀） 3. DE管活性最高管 4 Ni柱洗脱活性最高管 5. Mark（蛋白电泳位置） 6.? 7.? 8.??? 9. 10 点样量：20ul样品 （不足用buffer补足）＋ 20ulloadingbuffer 煮沸3分钟，离心 Ni柱点样：上清（1/3量） 、洗脱 Westen电泳位置！ Mark 点在最边上，并空行，用于染色 要求点两块板，顺序一致！ 预染Mark 样品处理勿忘！ Ni柱点样： Ni柱洗脱活性最高管1-8组 Mark 点在最边上，并空行，用于染色 要求点两块板，顺序一致！ 走电泳时左右方向不能错， 电泳结束后剪下Mark泳道，氨基黑染色 Western bloting 实验目的与原理Western bloting技术是用来检测蛋白表达的灵敏方法 由蛋白质的SDS、电转及杂交几部分组成 杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成 将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性结合的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜后，膜上仅在靶蛋白处结合抗体。 然后加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶显色反应，膜上结合靶蛋白位置即将呈现一定的颜色 从负极(黑孔板)到正极(白孔板)依次为： 黑孔板、凝胶支持纤维垫、滤纸、凝胶 凝胶支持纤维垫 滤纸 凝胶支持纤维垫 膜 滤纸 蛋白凝胶 大小剪裁： 胶准备：去除浓缩胶，去除一个角以定位，电转buffer浸10min 电转1－2小时 电转后用镊子取下膜，在Mark位置剪下条带，染色10分钟； 膜封闭：pH7.5，PBS （含5％脱脂奶粉），0.1％吐温20 冰箱过夜 洗涤： PBS（无Milk）洗三遍，每次10分钟 一抗： 用PBS （含1％脱脂奶粉， 0.1％吐温20 ）稀释 1：1000－1：3000，结合1－2小时，然后洗涤同上 二抗： 用PBS （含1％脱脂奶粉， 0.1％吐温20 ）稀释 1：1000－1：3000，结合1－2小时，然后洗涤同上 显色：BCIP/NBT 水溶液中显色，用水冲膜终止反应 注意：全程操作带手套！ 考马斯亮兰法测定蛋白浓度 1 用考马斯亮兰方法精确测定上样前蛋白和合并液蛋白含量： 2.5 mlBradford试剂＋450ul＋50ul样品混匀， 2分钟左右测定OD595 （注意稀释倍数和线性范围） 2 计算上样液和合并液比活，并计算离子交换柱回收率。 3 枪头使用：底物、测活buffer、Bradford试剂各一个 4 登记数据 实验报告撰写 测酶标方法： 原则上在自己认为最可能出酶的部分以2取1间隔测酶活，找出自己的酶活爆表范围，第一次测酶活不用稀释，在爆表的部分（找出爆表的边界）后，将爆表范围