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蛋白质分离和鉴定 德 伟 一.概述 蛋白质组及蛋白质组学概念的提出 蛋白质组学形成的历史 蛋白质组研究的主要手段 人类基因组计划的完成3-4万个基因，30亿对碱基（解码生命） 基因组是唯一的，但蛋白表达是变化的（解码生命） 后基因组—蛋白质组的研究是21世纪生命科学的主要任务（Wilkins MR et al 1997) 1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白 1995年Wilkins正式提出Proteome一词 由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，而研究蛋白质组功能为蛋白质组学（Proteomics） 存在问题 质谱技术 双向电泳 参考文献 解码生命-人类基因组计划和后基因组计划 科学出版社贺林 2000. 质谱技术的应用 蛋白芯片技术 激光捕获显微切割技术 （Laser Capture Microdissection ） 1. Prepare tissue 2. Locate cells 3. Place cap 4. Pulse laser 5. Remove cap 6. Extract molecules Before LCM After LCM Captured Cells Investigator? 蛋 白 组 学 研 究 系 统 高度自动化 率效率 蛋白鉴定 特定蛋白分离 操作灵活方便 高通量 多功能、自动化的大规模蛋白组学系统 二.蛋白质的分离和鉴定2:蛋白质的鉴定 质谱分析 ( MS) 分类：辅助激光解析/离子化&电喷雾离子化 原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/e )差异,分离样本,确定分子量 介质辅助的激光解吸/离子化 质谱技术 MALDI; matrix-assisted laser desorption/ionization,(介质辅助的激光解吸/离子化 ) ESI; electrospray ionization (电喷雾离子化 ) 多肽分析 多肽氨基酸分析 串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列），将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。 “protein ladder sequencing”的方法，通过对Edman降解法的修改，产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而推测N端序列。 局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。 Genomic Solutions’ 完整的蛋白组学研究系统 Produce 2-D Gels Image 2-D Gels Excise Spot From Gel Process Protein MS & Analyze Spot on MALDI Stage Analyze 2-D Gels Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 定量分析 图3.不同发育时期的大鼠胰腺总蛋白二维电泳图象。第一维电泳采用固相PH梯度凝胶胶条（PH4-7，线性），第二维电泳采用均一的12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。各时期蛋白上样量均为50μg，银染。加框区域内蛋白点各组间有显著差异。(a:E15.5；b: E18.5；c:P0；d:成年) 不同发育时期大鼠胰腺蛋白质组差异的分析 Pancreatic lipase related protein 1 precursor 22 5.30/22 5.79/52.38 P54316 32 peroxiredoxin 2 35 5.3/21 5.34/21.8 P35704 31 Peroxiredoxin 4 46 6.05/25 6.18/31.21 Q9Z0V5 30 Parkinson disease protein 7 homolog 78 6.16/23 6.32/19.9 O88767 29 apolipoprotein A-I 30 5.7/26 5.52/30 P04639 28 Alpha fetoprotein (AFP) 25 5.71/29 5.77/68.38 P02773 27 prohibitin 43 5.62/30 5.57/29.8 P67779 26 Trypsin V-A precursor 49 4.91/25 4.93/26.90 P32821 25 Protein FLN29 14 4.76/31 5.27/63.88 Q8CFI8 24 Chymotrypsinogen B 31 5.25/28 4.9/28.46