合成间苯三酚重组大肠杆菌的发酵条件优化.pdfVIP

合成间苯三酚重组大肠杆菌的发酵条件优化1 肖丹，高海军 北京理工大学，北京（10081 ） E-mail：dandan_dandan@126.com 摘 要：对本室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)/phlD 进行摇瓶发酵和发酵罐发酵 的优化探索。摇瓶优化条件：接种菌龄16h，接种量10%，装液量10%；诱导前菌体OD600 值 1.0，IPTG 终浓度0.5mM ，30 ℃诱导4h；诱导后接10%于发酵培养基，于37 ℃、220rpm 进行摇瓶发酵；优化发酵培养基以M9 盐为基础，添加酵母提取物和胰蛋白胨各10g/L，硫 酸铵0.05mol/L ，并加入甘氨酸0.1mol/L ，初始pH 7.0 ，初始碳源为葡萄糖20g/L ，16h 后补 加甘油 1.5%，发酵周期48h 。采用5L NBS 发酵罐进行初步放大，一级种子液为重组菌单菌 落在M9 中活化24h ，将其全部接入200mL LB 中活化12h，作为二级种子液接入发酵罐， 发酵培养基成分同摇瓶发酵，体系2L；发酵条件：34 ℃诱导、36 ℃发酵，pH=6.80 ±0.02 ， dO2 =20% ，其余同摇瓶优化条件。摇瓶优化条件下重组菌发酵 48h 合成间苯三酚产量达 811mg/L，发酵罐发酵重组菌48h 内间苯三酚产量最高达1128mg/L。 关键词：间苯三酚，重组菌，发酵条件优化 中图分类号：Q815 间苯三酚是一种重要的精细化工产品，可用作染料偶合剂、轮胎增粘剂、防腐剂、抗氧 化剂等[1,2] 。目前间苯三酚主要作为药物合成的中间体制备黄酮、异黄酮等抗癌、抗心血管 疾病类药物[3] 。间苯三酚别名斯帕丰（Spasfon)，是一种亲肌解痉药，广泛应用于无痛分娩 [4,5] 。间苯三酚及其衍生物广泛用于生防抗菌、抑制脾脏酪氨酸激酶等领域，如间苯三酚的 衍生物2 ，4-二乙酰基间苯三酚是一种重要的抗生素，具有广谱的抗菌活性。 目前国内外合成间苯三酚应用化学合成法，主要集中在以 1，3，5-三异丙基苯(TIP)为 原料的合成路线上，其氧化阶段产物复杂，氧化及酸分解过程中产生大量的副产物如焦油等， 难以分离纯化得到高纯度的产品[6] 。间苯三酚的广泛应用和化学法合成间苯三酚存在的种种 缺陷使生物法合成间苯三酚具有重要科研价值和实际意义。 在生物合成法生产间苯三酚途径中，微生物合成和代谢间苯三酚的过程尚未研究清楚。 研究荧光假单胞菌的生防机制中发现荧光假单胞菌Pf-5 的phlACBDE 基因簇编码乙酰基间 苯三酚的生物合成途径中，其产物除了2,4-双乙酰基间苯三酚和2- 乙酰基间苯三酚外，也能 够合成间苯三酚，phlD 基因的表达使间苯三酚在重组大肠杆菌中积累[7-12] 。荧光假单胞菌中 phlD 基因的克隆使重组菌能够以丙二酸单酰辅酶A 为底物，经过聚酮缩合环化形成间苯三 酚，通过基因工程和发酵工程等手段，优化重组菌发酵条件，提高产量，为进一步实现工业 化生产间苯三酚奠定了基础。 1 本课题得到“十一五”兵器预研支撑基金项目62301110604 资助。 - 1 - 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)/phlD ，由本室构建。 1.1.2 培养基 LB 液体培养基[12] ：酵母提取物5%，胰蛋白胨 10%，氯化钠10%，卡纳抗生素50μg/mL 。 M9 盐培养基[12] ：Na HPO 6.0g/L、KH PO 3.0g/L 、NaCl 0.5g/L 、NH Cl 1.0g/L，MgSO 2 4 2 4 4 4 0.24g/L，葡萄糖(单独灭菌) 20.0g/L ，pH 自然，卡纳抗生素50μg/mL 。