DNA琼脂糖凝胶电泳.docVIP

DNA的琼脂糖凝胶电泳）））TAE或TBE（0.5×或1×）））?C。 配方一：40% 蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝FF； 配方二：30%甘油水溶液，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝FF； 配方三：15% Ficoll(400型)水溶液，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝FF； 电压的选择 下表给出不同大小的DNA片段电泳时最佳的电压大小，供电泳时参考。这里的距离指的是正负两个电极间的距离，而不是电泳槽的长度。例如，最适电压是5V/cm，两个电极间的距离是26cm，则电泳时使用的电压应该是130V。 DNA大小 电压 ≤1kb 5V/cm 1-12kb 4-10V/cm 12kb 1-2V/cm 琼脂糖凝胶的制备及电泳 在进行琼脂糖凝胶电泳前，建议你最好测量一下你所用的塑料托盘的尺寸及所用的电泳槽两个电极间的距离。一般情况下，凝胶的最适厚度为3-5mm，根据这个标准及塑料托盘的长宽，就可以算出配胶时需要的缓冲液的量。知道了电泳时最适电压及两电极间的距离，就可选择合适的电压。 1．用封塑料托盘开放的两边，.根据欲分离DNA片段大小配制适宜浓度琼脂糖溶液准确称量琼脂糖干粉三角烧瓶或玻璃瓶中。.将胶液轻轻倒入托盘，使之形成均匀水平的胶面。凝胶适宜厚度为3～5mm。.在室温下30～45min。小心拔出梳子 向电泳槽加入电泳缓冲液，.混合DNA样品和样缓冲液用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔内。关上电泳槽盖，接好电极插头。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝0.5μg/ml的EB水溶液染色20min,若已加EB,则可直接将胶放在凝胶成像仪中观察实验结果。 注意事项 1. 溴化乙锭为中度毒性、强致癌性物质，操作时需小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。 2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右，而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。 参考文献 李德葆 徐平，1994，重组DNA的原理与方法，浙江：浙江科学技术出版社。 萨姆布鲁克，J 等著，金冬雁 等 译，1992，分子克隆实验指南（第二版），北京：科学出版社。 Gene company limited, Your complete guide for DNA separation and analysis.