神经红蛋白突变体Tyr44Phe的制备,表征和稳定性研究.pdfVIP

V01．30 高等学校化学学报 No．5 CHEMICAL 2009年5月 JOURNALOFCHINESEUNIVERS兀1ES 928—933 神经红蛋白突变体Tyr44Phe的制备、 表征和稳定性研究 李海丽1，李连之1”，郭玉静1，田素燕1，薛泽春1，姜玉岗1 (1．聊城大学化学化q-学院，聊城252059；2．南京大学配位化学国家重点实验室，南京210093) 摘要构建了突变体蛋白Tyr44Phe的基因，进行了蛋白的表达、分离纯化、谱学表征和稳定性研究，由电喷 雾质谱所得突变体蛋白的分子量与理论值一致；UV—Vis吸收光谱、荧光光谱和圆二色光谱表明，Tyr44Phe 的点突变虽没有改变血红素的六配位结构，但对血红素的构象有所影响．突变体蛋白的热、酸稳定性研究表 明，定点突变降低了血红素与蛋白肽链之间的结合力，导致血红素易从疏水腔中脱出，说明Ty,44对蛋白的 结构稳定性起一定的作用． 关键词神经红蛋白；突变体Tyr44Phe；稳定性 中图分类号0629．73；Q518．2文献标识码A 它由一条含151个氨基酸的肽链和血红素b组成．在古老脊椎动物珠蛋白的进化过程中，神经红蛋白 是最保守的一种H1，它对氧有固有的不稳定性，在氧存在时亚铁迅速被氧化为三价铁形式∞’6]．与传 统的珠蛋白(血红蛋白、肌红蛋白)所不同的是，在低铁和高铁状态下神经红蛋白中的血红素Fe都是 以六配位形式存在，其远端的His(E7)咪唑氮原子占据了第六配位位点．当外源性配体小分子(如0，， CO等)与之反应时，其远端的His(E7)需先解离后再与血红素配位结合，这在脊椎动物中尚属首例报 道．神经红蛋白的这种新颖结构必将赋予其新的功能．目前研究表明，神经红蛋白可能的生物学功能 包括氧载体、酶功能、对NO的解毒作用、作为氧传感器和保护神经元免受缺氧／缺血损伤“0J，但对 其具体的生物学功能还不清楚．与血红蛋白和肌红蛋白相比，神经红蛋白的化学生物学基本性质及其 结构、性质与功能关系的研究还远远不够，因此该蛋白的发现为生物无机化学和医药学研究提出了新 的课题． 我们已对野生型神经红蛋白和F28Y及F106Y突变体神经红蛋白进行了表达、分离纯化和谱学表 征¨h12o，这为神经红蛋白的化学生物学研究奠定了 基础．定点突变是研究蛋白质结构、性质与功能关 系的有力手段，目前神经红蛋白的定点突变工作主 要集中在蛋白质分子内二硫键及血红素轴向配体 上K’”一引．由神经红蛋白的晶体结构¨钊(图1)可 知，Tyr44(CD3)和血红素的一个丙酸根之间距离 较近(0．2637am)，它们之间存在着氢键相互作用， 且Tyr44(CD3)距离血红素远端轴向配体His64 (E7)较近Ⅲ1．因此，Tyl’44的改变可能会影响蛋白 StructIlnofhuman Fig．1 nuetooobin 质疏水腔内的局部结构、血红素与肽链的结合能力Th。。iteofth。T，mi。。arked． 以及蛋白质的稳定性，进而影响到Ngb的生物学功能．但Tyr44对Nsb的性质、结构及生物学功能有 何影响还不清楚．为考察这一问题，我们利用蛋白质定点突变技术，将这个位点的Tyr突变为Phe，以 收稿只期：2008-09-22． 基金项目：国家自然科学基金(批准号资助． 联系人简介：李连之，男，博士，教授，主要从事生物无机化学研究．E．mail：lilianzhil963@163．corn 李海丽等：神经红蛋白突变体Tyr44Phe的制备、表征和稳定性研究 929 过电喷雾质谱、uV．Vis吸收光谱、荧光光谱和圆二色(CD)光谱对该突变体蛋白进行了表征分析，研 究了该突变对蛋白结构及其对热和酸稳定性的影响． 1 实验部分 1．1试剂与仪器 带有神经红蛋白基因的pET3a质粒由德国BurmesterT．教授惠赠．E．Coli Ltd．，Engla