质粒抽提常见问题与解答.docVIP

1.没有提出质粒或者质粒收获量很低　　　　A菌种老化　　　　建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。　　　　B低拷贝质粒　　　　建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。　　　　C质粒丢失　　　　建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。　　　　D裂解不充分　　　　建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。　　　　EBuffer中有沉淀未溶解　　　　建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37温育片刻，待溶液澄清后使用。　　　　FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇　　　　建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。　　　　G离心柱中乙醇残留　　　　建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。　　　　H洗脱液加入位置不正确　　　　建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。　　　　I洗脱液pH值不正确　　　　建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。　　　　J洗脱体积的选择　　　　建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。　　　　K洗脱时间的选择　　　　建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。　　　　2.质粒纯度不高　　　　A蛋白质污染　　　　建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。　　　　BRNA污染　　　　建议：检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA应该存放在4，如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseA。　　　　C基因组DNA污染　　　　建议：加入BufferB1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。　　　　D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株　　　　建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。　　　　3.加样时DNA飘出加样孔外　　　　原因：柱中残留乙醇未除干净。　　　　建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。