植物病毒检测技术进展介绍.docVIP

植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒； 检测技术； PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形2. 免疫-血清检测方法 2.1.血清学检测法 目前血清学技术依然是植物病毒病原检测中最常用的方法之一，它是上世纪世纪六七十年代诞生的病毒检测技术，此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的，利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体，从而进行病毒的定性定量分析。其中重要的一些方法有：补体结合测定法（补体能在抗体存在的情况下通过补体的酶作用溶解红细胞和革兰氏阴性菌）、沉淀法（不同病毒类型在电解质存在时抗体与同源抗原相互结合形成的沉淀也不同）等。利用基因工程的方法从大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中高效表达病毒的外壳蛋白， 纯化表达产物制备抗血清具有特异性强的特点，可弥补常规方法的不足[4]。 2.2.酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理，只是在抗体上附带了酶标记，从而使反应可以有颜色强弱的变化，利于定时定量监测病毒浓度。此法灵敏度高，且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰。ELISA基本类型主要有间接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫双抗体夹心ELISA)[5] 、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)等(Accotto et al., 2000; AccottoNoris, 2007;孙伟等,2002)。其中TAS-ELISA是检测TYLCV常用和有效的手段之一。 1976 年Voller等首次将 ELISA 方法用于检测植物病毒，Clark 和 Adams 等[6]在1977年首次对植物病毒病原利用酶联免疫法进行了鉴定。ELISA 方法可以检测出 0.1～10 ng/mL 的病毒，特异性很强、操作简单、简便有效，国内外已研发出许多商品化的 ELISA 试剂盒[7-10]。因此，在植物病毒检测中 ELISA技术也广泛地应用于病毒病的鉴定和进出口检疫上。这种酶联免疫吸附测定(ELISA)是结合了酶的高效催化作用和抗原抗体的免疫反应，酶与抗体通过化学方法相结合而形成酶标抗体，酶标记抗体直接与包被在固体支持物上的待测抗原或抗体特异性结合或通过免疫桥特异性结合，再在酶的作用下使底物产生有颜色或高电子密度的可溶性产物，结果通过肉眼或比色法来进行定性的测定，从而得到抗体的性质和数量。 2.3.基于酶联免疫吸附法的新技术 2.3.1组织印迹法 此方法包括斑点免疫结合测定法(DIBA-ELISA 或 dot-ELISA)、直接组织斑点免疫测定(IDDTB-ELISA)等[11]。这些技术直接将组织印迹在膜上, 不仅保持了 ELISA 的灵敏性和特异性等特点, 而且简化了操作程序, 使病毒检测更加快速、简单、方便, 且印迹在硝酸纤维膜上的样品保存时间较长, 检测结果能直观地显示出病毒感染的部位, 适用于植物病毒的大规模普查。 2.3.2免疫毛细管区带电泳技术 免疫技术与电泳技术结合发展出了免疫毛细管区带电泳技术(Immuno Capillary Zone Electrophoresis,I- CZE)。I-CZE 将血清学反应的专化性和毛细管区带电泳的灵敏、快速、可自动检测等特点结合起来, 实时检测抗原-抗体复合体，I-CZE 可快速分析多个样品, 因而