【2017年整理】外源与基因在真核细胞中表达及调控.docVIP

第七章______ 外源基因在真核细胞中表达及调控第一节_______ 真核细胞基因表达的调控第二节_______ 哺乳动物细胞表达系统的选择 标记基因第三节_______ 真核细胞表达系统的载体种类第一节_______ 真核细胞基因表达的调控一,真核生物基因表达的特点及优势二,真核细胞表达及调控元件第二节_______ 哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因一,胸苷激酶基因选择标记(定义)二,二氢叶酸还原酶基因选择标记三,新霉素抗性基因选择标记四,氯霉素已酰转移酶基因选择标记五,黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶(XGPRT)基因第三节_______ 真核细胞表达系统的载体种类一,载体的类型二,几种常用的真核表达载体一, 真核生物基因表达的特点及优势 1.细胞的全能性 2.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区(调控序列)4.有三种不同RNA聚合酶参与转录5.初级转录产物能进行剪接加工修饰6.不存在操纵子结构7.基因多拷贝,功能基因分散在不同区域,分别转录二,真核细胞表达及调控元件 (一)真核生物基因转录水平的调控 (二)转录后水平的调控 (三)翻译水平的调控 胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶(thymidine Kinase,TK)在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成.一,载体的类型1.质粒型载体 2.病毒载体 3.整合型表达载体 4.游离型表达载体 5.瞬时表达载体6.稳定性表达载体7.非复制性HSV-病毒(单纯疱疹病毒HSV-型)载体 8.裂解性HSV-病毒载体 二,几种常用的真核表达载体一 逆转录病毒载体 1.卸甲载体 2.穿梭载体 二 痘类病毒载体 三 HSV-单纯疱疹病毒载体 1.重组病毒型载体 2.重组质粒型载体 3.裂解型病毒载体 (一)真核生物基因转录水平的调控 基因调控的顺式作用元件启动子增强子RNA剪接信号负调控元件终止子和polyA信号基因调控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用规律(二)转录后水平的调控mRNA前体加工:转录的mRNA前体经5加帽,3酶切加尾去除内含子后,产生成熟mRNA,通过核孔进入胞质中.RNA编辑(RNA editing)(三)翻译水平的调控翻译起始序列eIF-2的磷酸化反应由模板来源的遗传信息,进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质,这是生物适应性的保护措施.顺式作用元件顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子,增强子,RNA间接信号,负调控元件,终止子等调控元件.反式作用因子主要作用规律同一DNA序列可被不同蛋白质识别同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系,多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后,再与DNA结合,发挥调节作用.反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性,可塑性.反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域,有两种类型:通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域,如:锌指结构.转录调节因子的结构域又称转录活化结构域,如:酸性α-螺旋结构域.不同结构域各自的特征不同结构域各自的特征通用转录因子的DNA结合结构域锌指结构亮氨酸拉链螺旋-转角-螺旋(HTH)螺旋-环-螺旋转录调节因子的转录活化结构域RNA编辑(RNA editing)RNA编辑是在转录时或转录后,能够改变RNA分子编码特性,是与剪切形式不同的一种修饰形式,如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA,使C变U,编辑的结果形成了UAA终止密码子,在编码酶的作用下,除使C变U,还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加,使前体mRNA变成成熟mRNA时,通过插入或替换方式,可改变和扩大原遗传信息,编码多种蛋白,是生物的适应性保护.翻译起始序列在ATG起始密码子周围要有5-CCACCA-TGG-3保守序列,以利mRNA翻译起始,若发生突变,其翻译水平可下降10倍.在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列,也会影响翻译,建议外源基因的5端AUG上游序列不宜过长.eIF-2的磷酸化反应eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子.若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录,就会形成双链互补mRNA,而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶(DAI PK)该激酶可使eIF-2的α-亚基磷酸化,转译受抑,为防止该激酶活化,常在载体上加上腺病毒的VARNA基因,VA