脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达和表达产物性质的研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１）：２５～２９ 脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及 表达产物性质的研究  贾建波 　李相前　胡　敏 （淮阴工学院生物工程系　淮安　２２３００３） 摘要　从环境中筛选到了脂肪酶高产菌株金黄色葡萄球菌ＪＨ，依据ＮＣＢＩ上发表的原核微生物脂 肪酶基因序列的多序列比对，发现它具有很强的序列保守性。利用ＰＣＲ从金黄色葡萄球菌ＪＨ基 因组中扩增得到了脂肪酶基因，利用基因重组技术将其整合到质粒ｐＣ１９４中，并导入到枯草芽孢 杆菌中进行表达。应用选择抗药性筛选重组子，利用硫酸铵沉淀法和离子交换层析分离纯化重 组脂肪酶，并用ＳＤＳＰＡＧＥ进行纯度鉴定，确定其相对分子量约为３２ｋＤａ。通过对其酶学特性的 研究发现，重组脂肪酶在反应温度为４１℃，ｐＨ为８．０时具有最大活性，其 Ｋｍ和 Ｖｍ各自为 ２＋ ＋ ２＋ ２＋ ２＋ ２＋ ０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ和３０８ｍｏｌ／ｍｇ·ｍｉｎ，Ｃａ 、Ｋ 、Ｍｇ 能激活这种酶的活性，而Ｆｅ 、Ｃｕ 、Ｃｏ 则抑 μ 制它的活性。 关键词　金黄色葡萄球菌ＪＨ　脂肪酶基因　枯草芽孢杆菌Ｈ１１　表达　酶学特性 中图分类号　Ｑ７８ 　　脂肪酶（ｌｉｐａｓｅ，Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）全称为三酰基甘油 隆出脂肪酶基因，利用基因重组技术构建脂肪酶基因 酯水解酶（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ），是一类特殊酯 的分泌表达载体，并在枯草芽孢杆菌中分泌表达。有 键水解酶，不仅能催化天然底物油脂水解，也能在非水 关金黄色葡萄球菌脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表 相中催化酯合成、转酯化等反应［１］。近年来，随着非水 达，国内外尚未见相关报道。 酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩 １　材料与方法 ［２，３］ 展，但由于制备脂肪酶成本高，不适宜工业化生产 。 然而，脂肪酶广泛地存在于动物组织、植物种子和微生 １．１　菌种与质粒 物体中，尤其在微生物中有着广泛的分布，据估计，细 　　金黄色葡萄球菌ＪＨ分离自食堂下水道污水，表达 菌有２８个属、放线菌４个属、酵母菌１０个属、其它真菌 宿主枯草芽孢杆菌Ｈ１１本实验室保存。质粒ｐＣ１９４载 ［２］ 体购于ＴａＫａＲａ公司。 ２３个属共计达６５个属的微生物产脂肪酶 。微生物 脂肪酶种类多，通常在ｐＨ３．５～ｐＨ８．５之间水解能力 １．２　试　剂 较强，部分脂肪酶在ｐＨ１０时仍有稳定的活性，最适酶 　　ＲＮａｓｅＡ购于 Ｓｉｇｍａ公司，溶菌酶为 Ｓｅｒｖａ公司产 ［２］ 品，ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｓｐＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶以及所有ＰＣＲ相关试 解温度在３６℃～４５℃之间 ，使得它在脂肪酶的应用 领域倍受青睐，然而在短时间内应用传统的诱变野生 剂和回收试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司，ＰＣＲ引物委托华美 菌的方法筛选出具有某些特定性质的脂肪酶是不现实 生物工程公司合成，其它实验试剂都是国产或进口分 的，所以用基因工程方法生产脂肪酶已成为必然。 析纯和化学纯。 　　应用ＰＣＲ技术从金黄色葡萄球菌ＪＨ的ＤＮＡ中克 １．３　培养基的配制［４］ 　　富集培养时用液体富集培养基，脂肪酶高产菌株 收稿日期：２００７０８２０　　修回日期：２００７１１０５ 江苏省