凝胶层析技术(凝胶过滤)分析.pptVIP

凝胶层析技术（凝胶过滤） 湖南师大生科院-2012 目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。 其结构如图： 实验步骤 1、凝胶的预处理 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂，自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。 。 3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。 四、凝胶层析的特点 1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。 2、设备简单，操作简便。 722分光光度计使用方法 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min; 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应; 调好波长; 调节按钮 开盖时，调 T 参数 调为 100 合上盖，调 A 参数 调为 0; 逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）; 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。 * * 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography 定义 ● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 原理 分配系数（Kd） Ve=Vo+KdVi (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出 (1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (3) 0 Kd 1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 Kd=0 0＜Kd1 Kd=1 洗脱体积 小分子量 大分子量 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子化合物。 （一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。