凝胶层析纯化苯丙氨酸解氨酶分析.ppt

实验（二）凝胶层析纯化苯丙氨酸解氨酶（8学时） 一、实验背景 掌握凝胶柱层析法脱盐的原理和基本操作方法，分离上一个实验所得沉淀液中的酶蛋白和硫酸铵。 二、实验原理 分子筛： 根据不同蛋白分子量大小的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。 空间排阻 1. Spherical particles packed into a column. 2. Sample applied. 3. Buffer (mobile phase) and sample move through column. Molecules diffuse in and out of matrix 4. Large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size. Molecules larger than the matrix pores pass straight through. Diffusion Buffer Diffusion into the pores Diffusion out of the pores Buffer 纯化应用 组分离（Group separations ） 脱盐/换缓冲液（desalting, buffer exchange, removing reagents） 精细分离（Fractionation of proteins and peptides complex samples, monomer/dimer 聚集体去除 Estimation size size homogeneity 分子量/均一性 monomer dimer mAU 0 500 1000 1500 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 ml 三、实验试剂 0.2mol/L磷酸缓冲液（ pH8.0，含0.5mmol/L EDTA,2.5%甘油，临用前加β-巯基乙醇，使其浓度为20mmol/L）； Sephadex G-25； 0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.7）； 0.6mmol/L L-phe溶液； 6N HCl溶液； 三、实验试剂 考马斯亮蓝G-250蛋白染色液 (1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml. (2) 考马斯亮蓝G-250试剂 取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。 四、实验步骤 1. Sephadex G-25；层析脱盐： 1）凝胶溶胀：称取Sephadex G-25 5克，加入适量0.02mol/l磷酸缓冲液于沸水浴上溶胀一小时（或在室温下溶胀，时间延长。20℃下3小时）。待溶胀平衡后，稍静置，倒去上层清液中的细小凝胶颗粒，再加适量缓冲液，小心用剥棒搅起，静置片刻，再倒去上层清液中细小颗粒，这样处理2-3次； 2）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。把处理好的Sephadex G-25；，加入适量0.02mol/L磷酸缓冲液，用玻棒小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml磷酸缓冲液不断加入柱内洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应符合无气泡、无节痕、床面平正； 实验步骤1. Sephadex G-25；层析脱盐 3）上样：让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面中央1毫升沉淀液[2]（上一实验中所得），注意不要冲坏床表面。打开止水夹，并用刻度试管收集流出液，待样液几乎全部进入胶床表面后，吸取1毫升磷酸缓冲液，把吸附在玻璃壁上样液洗入柱内，在床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹，再小心地用滴管加入5-6厘米高的磷酸缓冲液洗脱； 4）洗脱收集：取刻度试管5支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸缓冲液洗脱，下面不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集2b毫升。收集结束后，床表面可加一定缓冲液继续洗脱清洗，凝胶层可反复使用。 实验步骤 管号 　0 　1 　1’ 　2 　2’ 　3 　3’ 　4 　4’ 0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.7）（ml） 　4.0 　3.95 　4.95 　3.95 　4.95 　3.95 　4.95 　3.95 　4.95 脱盐中洗脱液 第2号(ml) 　/ 　0.05 　0.05 　/ 　/ 　/ 　/ 　/ 　/ 脱盐中洗脱液 第3号(ml) 　/ 　/ 　/ 　0