2.1固相析出分离技术.doc

2.1固相析出分离技术 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出分离技术。根据析出物的形态不同分为结晶法（结晶析出）和沉淀法（无定形固体析出） 第一节 沉淀分离技术 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。 一、盐析沉淀法 1.盐析的原理定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示：lg（S/So ）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可 改写为：lgS = lgSo – KsI = β – KsI β=lgSo为一常数 β值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关 ；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大， 盐析效果越好。 所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度Ｉ,Ｉ可用下式计算： Ｉ = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度Zi：离子的价数对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 2.盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。 3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 : 通常硫酸铵的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： （1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。 2)?加入固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2）S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。 实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表，室温用25℃） 4.影响蛋白质盐析的因素： （1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在25－30g/L。 （2）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强 3）pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 （4）温度的影响 a.在低离子强度或纯水