HBV源性MicroRNA前体分子预测论文.docVIP

　　HBV源性MicroRNA前体分子预测论文 【摘要】 目的： 预测HBV基因编码的microRNA分子前体. 方法： 采用VMir软件，对HBV全基因进行扫描，通过对所得序列的评分及结构分析，得到HBV编码的microRNA的候选前体分子；通过Northern blot实验，对预测结果进行初步验证. 结果： 通过VMir的预测，得到3个HBV可能编码的microRNA分子前体，即MD6，MD20.freelicroRNA前体分子. 【关键词】 肝炎病素 乙型 微RNAs 预测 0引言 MicroRNA是一类21～23 nt长的非编码单链小分子RNA，是由priRNA分子经过剪切成为70～90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体（premiRNA），再经Dicer酶加工生成［1］. MicroRNA广泛存在于真核生物中，迄今为止在人体中已经发现了至少320种MicroRNA分子. MicroRNA通过与mRNA的3′非编码区相互作用调控基因表达，在机体的生理及病理过程中发挥重要作用. 最近研究表明，一些病毒的基因组，如疱疹病毒、腺病毒、HIV，也能编码MicroRNA［2］. HBV基因组能否编码MicroRNA分子目前还不清楚. 本研究中，我们借助于预测软件VMir，对HBV全基因组进行正反两个方向的扫描，寻找HBV基因中编码microRNA前体分子，对HBV编码的microRNA分子进行初步预测，并通过Northern blot实验对其进行初步鉴定. 1材料和方法 1.1材料预测软件VMir由加利福尼亚大学Grundhoff AT教授惠赠. HBV全基因序列检索自Genebank，序列号为NC_003977，adr型. HepG2和HepG2.2.15细胞均购自ATCC. HepG2细胞培养选用含100 mL/L胎牛血清（Hyclone）RPMI 1640培养液（Gibco）. HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓度的培养液，另外加入终浓度380 mg/L的G418 (Sigma). 上述两种细胞均在37℃的含50 mL/L CO2孵箱中培养. Trizol购自Invitrogen公司. Northen blot所用尼龙膜购自Ambion公司. ［γ32P］ ATP购自北京福瑞生物工程公司. 1.2方法 1.2.1预测软件VMir工作原理VMir是由Grundhoff AT等［3-4］创建的一种病毒编码MicroRNA前体分子预测方法. 工作原理为：病毒基因序列以500 nt为一个窗口，10 nt递进扫描；RNAfold算法预测窗口内的发卡结构；限定发卡结构长度，按照以下规则评分：每个互补的碱基对奖励2分；末端环状结构超过17个碱基时，每超一个，减1分；对于对称性隆起，减去碱基数×1(碱基数≤4)或碱基数×1.5(碱基数﹥4) ；对于非对称性隆起，减去碱基数×2. 经上述处理，每个发卡结构得到一基数，再乘以系数Ip得到最终分值. 再进一步限定分值及其窗口出现频率（一般限定最低分值为115,窗口值即在不同窗口中出现的频率为35，因在该条件下成功预测概率为98%［4］）,最终得到病毒基因编码的microRNA前体分子. 该方法已经成功预测出KSHV（卡普西肉瘤相关病毒）、EBV（EB病毒）等编码的microRNA前体分子. 1.2.2利用VMir预测HBV编码的microRNA前体分子将HBV全基因序列(NC_003977)导入VMir软件，设定窗口大小为500 nt，递进单位为10 nt，发卡结构长度设为100 nt，对HBV基因组中能够形成发卡结构的序列进行初筛. 然后，设定以每个序列最低得分为115,其窗口值最低为35,得到HBV可能编码的microRNA前体分子. 1.2.3预测前体分子的初步验证我们选用Northern blot方法对经VMir软件筛选到的候选分子进行初步验证. 所用探针序列为候选microRNA分子的反相互补序列，用T4多聚核苷酸激酶末端标记放射性标记γ32P. 以稳定表达HBV的HepG2.2.15为研究对象，以HepG2细胞作为对照，按照试剂说明书，利用Trizol试剂提取总RNA. 取40 μg总RNA进行150 g/L TBE尿素凝胶电泳；再经半干转运至尼龙膜后，利用上述标记探针杂交、放射自显影. 如果经VMir预测到的候选分子是HBV基因编码的microRNA前体分子，那么来自于HepG2.2.15细胞的总RNA与探针杂交后，应出现两条特异性的条带：分子量较大的一条为microRNA前体分子，较小的一条为成熟的microRNA分子. 因为microRNA前体分子在Dicer酶作用下产生成熟的microRNA分子，而剩余的核苷酸将迅速被降解