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HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测论文.doc
HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测论文
刘敏,张伟,陈天艳,蔺淑梅,刘锦锋,叶峰,赵英仁,张树林
【关键词】 蛋白
Role of HCV core protein in yeast t in reporter gene expression and activation
【Abstract】 AIM: To construct the bait vector of HCV core protein in yeast t and then to study its effect on the groents encoding HCV core region plified by PCR and subsequently cloned into pUC19. After verified by sequencing, they . These rebinant plasmids ents of HCV core protein 3 can be utilized to fish HCV core regioninteracting protein. HCV core protein does not have selfactivating function.
【Key; reporter gene
【摘要】 目的: 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法: PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段.freelL微量离心管中,加入已构建好的诱饵载体0.1 μg,鲱鱼精DNA 0.1 mg和0.1 mL酵母感受态细胞. 混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液. 在30℃以200 r/min振荡培养30 min, 加入70 mL DMSO后混匀, 在42℃水浴15 min, 冰浴2 min, 5000 r/min离心5 s,去上清,以0.5 mL 1×TE重悬细胞后,铺于SD/Trp平板. 于30℃培养36 h左右,直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.
1.2.5蛋白表达的检测
1.2.5.1酵母全菌蛋白的抽提挑取几个已转化的酵母菌在5 mL SD/Trp培养液振荡培养过夜, 次日转接于50 mL SD/Trp培养液, 在30℃以230 r/min振荡培养至A600 nm=0.4~0.6. 在4℃,1000 r/min离心收菌. 将菌体置于液氮中冻存. 以60℃的裂解缓冲液200 μL融解菌体, 混匀后加入0.2 g玻璃珠, 70℃孵育10 min, 剧烈混旋1 min, 在4℃,5000 r/min离心5 min. 上清转移至新的Eppendorf管备用. 沉淀在100℃水浴5 min,再剧烈混旋1 min,在4℃,5000 r/min离心5 min后,上清转移至上述的Eppendorf管内, 100 g/L SDSPAGE电泳分析.
1.2.5.2r为19×103可见明显目的条带且无杂带(图4).
2.5HIS3报告基因表达的检测可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长,而含有pGBKT7核心蛋白质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长,但所有克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生长.
2.6LacZ报告基因表达的检测含有HCV核心蛋白的酵母细胞显色中可见LacZ报告基因没有被HCV 核心蛋白激活(图5). 当LacZ报告基因被激活时β半乳糖苷酶大量表达,活性增高,在Xagal存在时,菌落显深蓝色,且扩散面积较大.
3讨论
酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法[5]. 我们在酵母双杂交Gal4系统3基础上成功构建了融合有HCV核心蛋白的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白,再将含HCV核心蛋白的重组质粒转化入Ura缺陷生长的AH109酵母菌中. 通过Trp,Leu及His缺陷的营养筛选表明,带Trp营养筛选标记的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白已成功转化入带有Ura 营养筛选标记的AH109酵母菌中. 带有重组表达质粒的AH109酵母菌在His营养缺陷的SD培养基上不能生长,说明构建的HCV核心蛋白对HIS3基因无激活作用. 同时β半乳糖苷酶印膜法及平板法检测结果也表明构建的HCV核心蛋白对LacZ基因无激活作用. 说明HBV核心蛋白对AH109无毒性,且对报告基因无自激活作用. 这与体
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