HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响论文.docVIP

　　HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响论文 廖继佩，薛小平，尹文，雷迎峰，吕欣，杨敬，徐志凯 【关键词】 丙型肝炎病毒 Effect of HCV NS5A expression in HeLa cells on interferon sensitive virus VSV replication 【Abstract】 AIM: To demonstrate the effect of HCV NS5A expression on vesicular stomatitis virus （VSV） replication. METHODS: Stably transfected cells an rebinant IFNα2a ed and supernatants e points after infection. Changes in infectious virus yields easured by a standard virus plaque assay in Vero cells. RESULTS: EM7.5 g/L羧甲基纤维素钠(CMC) 1 mL. 继续培养48 h后移走培养液，结晶紫染色，自来水轻柔洗净，记录噬斑形成单位(PFU). 结果：干扰素(IFN)浓度为1×105 U/L，VSV对HeLaNS5A细胞的致病变作用要比对HeLaNS5AΔISDR细胞的致病作用更明显. 在整个IFN浓度处理中，HeLaNS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLaNS5AΔISDR细胞培养液中的病毒滴度的2~5倍(P 0.05). 结论：NS5A能增强IFN敏感病毒的复制，HCV NS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素. 【关键词】 丙型肝炎病毒;非结构蛋白5A;干扰素敏感决定区;水泡性口炎病毒;空斑形成单位 0引言 干扰素(interferon,IFN)是目前治疗丙型肝炎最有效的药物，但治愈率不到30%. 有人认为，NS5A内存在干扰素敏感决定区(interferonsensitivity determining region, ISDR)，影响IFN的抗病毒疗效. 在临床研究中，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) NS5A对IFN抗病毒治疗具有固有抗性的观点仍有争论. NS5A可利用所谓的ISDR外的序列来干扰或逃避IFN诱导的抗病毒效应,宿主介导的压力选择主要作用在NS5A的C端［1］，但是Mangoni等［2］认为ISDR的上游变异性与IFN治疗应答有关. 另外，NS5A可能与2′,5′寡腺苷酸合成酶(25OAS)相互作用，以ISDR非依赖机制抑制IFN的抗病毒活性［3］. 为了进一步探明HCV NS5A中是否存在影响IFN治疗的结构域，在已经成功构建的稳定转染HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞系的基础上，我们利用对IFN敏感的病毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)，在IFN存在的条件下通过对比分析VSV在这两株细胞系中复制的差异，探讨HCV NS5AISDR与IFN疗效的相关性. 1材料和方法 1.1材料 稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞系由第四军医大学基础部微生物学教研室构建; VSV病毒由第四军医大学生物技术中心提供(5×1010 PFU/L); Vero细胞由本室保存; 胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司; DMEM和HEPES购自Invitrogen公司; 结晶紫购自湖南化学试剂公司; 羧甲基纤维素钠(CMC，中等黏度，分析纯)购自天津市科密化学试剂开发中心; 小牛血清购于中美合资兰州民海生物工程有限公司; 人基因工程α2a型干扰素(rHuIFNα2a)购自第四军医大学生物技术中心(1×107 U/支). 1.2方法 称取1.5 g CMC，溶于100 mL三蒸水中，高压灭菌. 将配好的100 mL 2×DMEM移入盛有100 mL 15 g/L CMC的玻璃瓶中混匀，然后加入22 mL小牛血清，此即为含100 mg/L小牛血清的DMEM7.5 g/L CMC溶液. 称取5 g结晶紫，溶于100 mL无水乙醇，此即为50 g/L结晶紫贮存液. 待使用时移取50 g/L结晶紫贮存液8 mL，8.5 g/L NaCl 30 mL，甲醛2 mL，混匀后即为10 g/L结晶紫染色液. 将IFN加入培养上清液至终浓度为1×105 U/L，培养24 h后，按感染复数(MOI)=1加入相应体积的VSV病毒贮存液. 继续培养36 h后在倒置显微镜下观察VSV对稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞形态的影响.